提升头孢菌素C 发酵效率的复合碳源补料工艺开发及代谢机制

摘要：开发了一种以葡萄糖和豆油为底物碳源的复合补料策略，能够显著提升头孢菌素C（CPC）的合成效率，使其产量提升了14.8%，并观测到碳源变化在宏观呼吸代谢、中间代谢物、细胞内通量分配和还原力NADPH 利用方面产生了全局影响， 其中二氧化碳释放速率（CER）的变化表明在葡萄糖和豆油复合补料策略下细胞中心代谢网络的通量发生了明显改变，碳流向CPC 的通量得到增强，同时促进了蛋氨酸和丝氨酸的胞外吸收。胞内有机酸α-酮戊二酸、丙酮酸、苹果酸的浓度明显提升，有利于谷氨酸、缬氨酸和半胱氨酸等核心氨基酸的合成，从而有利于CPC 生产。主成分分析（PCA）的载荷测定结果表明大多数氨基酸和CPC 合成呈正相关，谷氨酸的胞内含量与CPC 合成的关联性最强，而α-氨基己二酸和赖氨酸积累反而不利于CPC 合成。细胞还原力方面，豆油和葡萄糖组合工艺有助于NADPH 更多地用于CPC 合成，使得CPC 快速合成时对NADPH 的大量需求得到了满足。这些结果表明改变底物能够对细胞内部的代谢产生全方位的影响，复合补料策略在优化CPC 合成中具有巨大潜力。

关键词：头孢菌素C；碳源；呼吸代谢；代谢通量分析；主成分分析

中图分类号：Q815 文献标志码：A

头孢菌素类药物占据抗感染类药物50% 以上的市场份额，国内市场规模已达400 多亿元，因此其前体头孢菌素C（CPC）的生产研究备受关注。CPC 是由顶头孢霉菌（Acremonium chrysogenum）发酵生产的次级代谢产物，与一般次级代谢物的合成调控类似，CPC 的发酵水平同样受到碳代谢调控、氮代谢调控、磷代谢调控等影响[1]，其中碳源效应受到持续关注[2]。通常来讲，能够快速利用的碳源会严重抑制次级代谢产物的合成，因此发酵培养基定制策略往往是前期采用快速利用的碳源如葡萄糖、麦芽糖等促进菌体生长，待快速碳源耗竭后，中后期采用慢速利用的碳源如油脂、淀粉等用于刺激次级代谢产物的合成[2]，这个策略在很多次级代谢产品的生产中得到了应用，比如诺卡氏菌（Nocardia lactamdurans）只有在葡萄糖消耗到极低浓度后，依托霉素才启动合成，而大豆油则促进了依托霉素的生物合成[3]；白色链霉菌在豆油作为底物时，产生的抗生素浓度明显更高[4]；蓖麻油是更适合红色糖多孢菌产红霉素的碳源[5]；甘油或植物油能够刺激克拉维酸的合成[6]；头霉素C 能以豆油作为唯一碳源进行发酵生产[7]，这些结果表明油脂用于次级代谢产物合成具备普遍性的优势。

在顶头孢霉菌中，CPC 合成途径中的扩环酶基因cefEF 和环化酶基因pcbC 的上游序列存在碳分解代谢调控蛋白Cre1 的结合位点，cefEF 和pcbC 的转录水平在葡萄糖培养基中受到阻遏，表达水平显著下降[2]，而豆油不会阻遏CPC 合成途径中的基因表达，因此豆油被认为是CPC 合成期间的最佳碳源，并且豆油能够激活交替呼吸途径，加快NADH 的周转速率，提高CPC 合成过程的能量供应，从而更有利于CPC 的高产。然而近期Li 等[8] 通过研究豆油在不同发酵阶段的代谢分析，首次发现了CPC 合成期间仅仅采用豆油会导致NADPH 和ATP 利用的不经济性，可能影响CPC 的发酵水平进一步提升，表明该策略存在优化空间。

本文以顶头孢霉菌为研究对象，首次成功开发了更适用于CPC 发酵合成过程的葡萄糖和豆油复合底物补料新策略，显著提升了CPC 的合成速率，与仅采用豆油补料相比，CPC 发酵水平提升了14.8%。底物对次级代谢物合成的调控是个古老但未充分理解的课题[9]，本文从宏观代谢研究、代谢物水平、代谢流、还原力和能量水平进行了系统解析，这也对其他次级代谢产物发酵过程中的碳代谢调控具有重要的启示意义。