正交试验优化桂附颗粒壳聚糖除杂工艺

【摘要】目的：采用正交试验优化桂附颗粒壳聚糖除杂工艺。方法：以肉桂酸保留率和杂质去除率为评价指标，絮凝除杂温度、壳聚糖加入量、药材-药液比为影响因素，正交试验优化工艺。结果：最佳条件为絮凝温度60℃，药材-药液比1∶[KG-*3/5]7，壳聚糖加入比例1.4g/L，肉桂酸保留率为90.88%和杂质去除率14.94%。结论：该方法简单可行，能保证药液中肉桂酸高保留率及杂质较高去除率。

【关键词】桂附颗粒；壳聚糖；除杂工艺；正交试验

【中图分类号】R284.1

【文献标志码】A【文章编号】1007-8517（2024）18-0040-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.18.zgmzmjyyzz202418009

Abstract：ObjectiveTodeveloporthogonalteststooptimizeguifugranuleflocculation.Methodsusingcinnamicacidretentionrateandimpurityremovalrateasevaluationindexes，chitosandosage，flocculatingtemperatureandratioofcrudedrugtoliquiddrugasinfluencingfactors，Tooptimizethetechnology，orthogonaltestswereconducted.Resultstheoptimumconditionswereasfollows：Chitosan1.4g/L，flocculationtemperature60°C，ratioofmedicinalmaterialstomedicinalsolution1∶[KG-*3/5]7，cinnamicacidretentionrate90.88%andextractremovalrate14.94%.Conclusionthemethodissimpleandfeasible，whichcanensurethehighretentionrateofcomponentsandimprovetheliquidmedicine.

Keywords：GuifuGranule;Chitosan;ImpurityRemovalProcess;OrthogonalTest

桂附颗粒由桂枝、生姜、白附片、白芍、炙甘草、大枣组成，源于《伤寒杂病论·辨太阳病》：“太阳病，发汗，遂漏不止，其人恶风，小便难，四肢微急，难以屈伸者，桂枝加附子汤主之。”桂附颗粒是我院名老中医的常用处方转化而来，有临床使用历史，作为医院协定处方，效果显著。可调和营卫、扶阳固表、祛风温经、助阳化湿。主要用于治疗因营卫不和、发汗过多而致汗证、阳虚感冒、产后汗出、漏汗、遗精、阳虚气血运行不畅寒湿痹痛等。临床采用传统汤剂方法煎煮，患者使用、携带不方便，储存条件要求高。因此将该方剂开发为颗粒剂，具有“三效”“五便”“三小”优点，既能如汤剂快速发挥作用，又易携带和使用［1-2］。但是此方中药味出膏率高，日处方量浸膏约20g，如不除杂直接制备颗粒，将导致日服用剂量过大，故进行除杂工艺试验以降低患者服用量。本课题组拟采用正交法优化桂附颗粒壳聚糖除杂工艺，优选出最佳纯化工艺条件，为桂附颗粒研制奠定基础。

1仪器与试药

1.1仪器万分之一分析天平（上海安亭电子仪器厂）；Agilent1260Infinity高效液相色谱仪（配置四元泵、自动进样器、UV检测器）;十万分之一分析天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；GZX-3-BS-Ⅱ/H型烘箱（上海跃进医疗器械有限公司）。

1.2试药肉桂酸对照品（批号110786-201604）从中国食品药品检验研究院采购。桂枝、生姜、白附片、白芍、大枣等5味药材均购自四川天植股份有限公司；壳聚糖（批号20210928，湖南新绿方药业有限公司），炙甘草药材从成都康美药业生产有限公司采购；药材皆满足《中国药典》2020年版（一部）项下有关规定。试剂使用色谱甲醇、色谱乙腈、超纯水，其他试剂则是AR级。

2方法与结果

2.1水提液制备将桂附颗粒处方，加10倍水浸泡40min后，煎煮提取两次每次1.5h，收集两次滤液，浓缩至药材-药液比为1∶5、1∶6、1∶7，即得。

2.2壳聚糖溶液制备取10mL冰醋酸加入纯水中制成1L1%冰醋酸溶液；再称取壳聚糖10g，加入1L1%冰醋酸溶液中，溶胀24h，即得0.01g/mL壳聚糖溶液［3］。

2.3壳聚糖纯化工艺正交试验设计以肉桂酸保留率、杂质去除率为评估指标，通过单因素实验筛选出药液浓度、壳聚糖加入量、温度为考察因素，各因数皆设3个水平，进行试验［4］。取“2.1”项下各水平梯度浓度的溶液，置于不同水平的温度中水浴加热，并加入不同比例1%壳聚糖溶液，搅拌20min后，保温1h，静置过夜，管式离心收集上清液定容至规定刻度备用。因素水平见表1。

2.4肉桂酸保留率测定

2.4.1色谱条件采用HPLC测定，在30℃柱温下，色谱柱：ZORBAXSB-C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；检测波长：285nm；乙腈∶0.1%磷酸=30∶70；流速：1.0mL/min；进样量：10μL［5］。

2.4.2对照品溶液制备取肉桂酸对照品，精密称取13.52mg（浓度为98.8%）到50mL量瓶中，甲醇定容后，再取0.4mL母液至25mL量瓶中，加甲醇至刻度线，即得（4.27μg/mL）［6］。

2.4.3供试品溶液制备精密吸取“2.1”待测液5mL，置于磨口三角瓶中，精密加入10mL甲醇，精密称重，超声30min，放冷后精密称重，以甲醇补足重量，摇匀，用微孔滤头滤过即得。同“2.4.1”法测定肉桂酸含有量，计算保留率，公式：肉桂酸保留率=（样品中肉桂酸含有量/原药液中肉桂酸含有量）×100%。

2.4.4缺桂枝阴性对照溶液制备取缺桂枝的桂附颗粒处方，按照“2.1”项下方法制备，浓缩，再按照“2.4.3”项制备阴性对照。

2.4.5专属性考察将上述对照品溶液、缺肉桂酸阴性溶液、沉淀处理前供试品溶液和沉淀处理后供试品溶液，以2.4.1项下方法进样，结果如图1所示。

实验结果表明，阴性样品色谱图中在与肉桂酸对照品相应的保留时间处没有色谱峰，说明其他成分对肉桂酸的测定无干扰，供试品色谱图中肉桂酸色谱峰与相邻色谱峰分离度大于1.5，符合要求，表明以本法测定桂附颗粒中肉桂酸的含量具有专属性。

2.4.6线性关系考察分别精密量取0.2672mg/mL的肉桂酸对照品贮备液0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL至25mL容量瓶中，加甲醇稀释至不同浓度的对照品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件依次进样10μL，记录色谱峰面积，以峰面积为纵坐标（y），对照品浓度为横坐标（x），绘制标准曲线。求得回归方程为：Y＝75.867X+2.9059（R2=0.9999）。见表2，结果如图2所示。

结果表明，肉桂酸在0.0107～0.0855μg的数值内与峰面积积分值线性关系良好，符合要求。

2.4.7精密度考察精密吸取对照品溶液10μL，按“2.4.1”项下色谱条件连续进样6次，以保留时间及肉桂酸峰面积计算RSD值。结果显示肉桂酸保留时间的RSD为0.1%，峰面积的RSD为0.1%，说明仪器的精密度良好。

2.4.8重复性考察取供试品6份按“2.4.3”项下的制备方法制备供试品溶液，色谱条件同“2.4.1”项下色谱条件进行测定，测定供试品溶液中肉桂酸的含量。实验结果显示，同一批号样品制备的6份供试品溶液，肉桂酸含量平均值为5.2μg/g，RSD为0，表明该分析方法的重复性良好。

2.4.9稳定性考察取对照品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进行测定，在1.5h、7.5h、14h、20h、26h、32h分别进样10μL，记录色谱图。取“2.4.3”项下供试品溶液，在4h、6.5h、14.5h、20.5h、26.5h、32.5h分别进样10μL，记录色谱图。结果显示32h内，肉桂酸对照品峰面积的RSD<2%，供试液中肉桂酸含量的RSD<2%，说明肉桂酸对照品溶液和桂附颗粒供试品溶液在32h内稳定性较好。

2.4.10加样回收率试验精密称取10.07mg的肉桂酸对照品，置25mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度线，制成每1mL含0.3980mg的溶液。精密量取3mL至100mL量瓶中，加水稀释至刻度，制成每1mL含0.01194mg的溶液。再精密量取5mL至10mL量瓶中，加水稀释至刻度线，制成每1mL含5.969μg的准确度对照品溶液。

取供试品约5mL，精密称定，平行6份，分别精密加入上述准确度对照品溶液5mL，加水至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“2.4.1”项下色谱条件进行测定，分别进样，计算加样回收率。结果见表3。

结果显示，肉桂酸的加样回收率范围为96.67%～100.00%，平均加样回收率为98.34%，RSD为1.9%，准确度较高。

2.4.10稳定性考察取对照品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进行测定，在1.5h、7.5h、14h、20h、26h、32h分别进样10μL，记录色谱图。取“2.4.3”项下供试品溶液，在4h、6.5h、14.5h、20.5h、26.5h、32.5h分别进样10μL，记录色谱图。结果显示32h内，肉桂酸对照品峰面积的RSD<2%，供试液中肉桂酸含量的RSD<2%，说明肉桂酸对照品溶液和桂附颗粒供试品溶液在32h内稳定性较好。

2.5杂质去除率测定精密量取“2.1”项下各浓度原液及“2.3”项下与之对应的10mL壳聚糖操作后溶液，分别水浴蒸干后，放置于烘箱中105℃干燥3h，精密称重。公式：杂质去除率（%）=（壳聚糖操作前干膏重-壳聚糖操作后干膏重）/壳聚糖操作前干膏重×100%

2.6正交试验设计与结果采用正交试验设计，以肉桂酸保留率及杂质去除率为评价指标，采取综合加权评分的方法对结果分析测算。赋予肉桂酸保留率权重系数0.6、杂质去除率权重系数0.4，计算方式：综合评分=（肉桂酸保留率/肉桂酸保留率最大值）×0.6+（杂质去除率/杂质去除率最大值）×0.4［7］。见表3、表4。

由表2和表3结果可知，考察指标为肉桂酸保留率及杂质去除率两因素的综合评分，因素A、B、C均无显著影响（P＞0.05），从表2中可知：A3＞A1＞A2，B2＞B1＞B3，C2＞C1＞C3，D1＞D3＞D2，结合极差分析，确定最优壳聚糖除杂工艺是A3B2C2D1，即搅拌时间20min，生药∶[KG-*3/5]药液浓度为1∶[KG-*3/5]7，絮凝温度60℃，壳聚糖加入量为1.4g/L。

2.7最优壳聚糖除杂工艺验证以筛选出的最优工艺条件，进行3次连续验证试验，结果见表5，可见该除杂工艺可行。

3讨论

3.1指标成分选择参考《中国药典》2020年版一部“桂枝茯苓丸”〔含量测定〕桂枝的含量测定方法，方中桂枝为君药，其主要活性成分为肉桂酸、桂皮醛，根据药理学的研究［8］，肉桂酸具有消炎解热、抗氧化、抗肿瘤等多种药理活性，经供试品前处理考察及分析方法验证，建立了以高效液相色谱法测定桂附颗粒肉桂酸的含量测定方法，其中桂皮醛并不稳定，为挥发性成分，且易氧化分解，该处方采用传统水提煎煮，导致提取液中桂皮醛含量低，不宜作为指标性成分。以肉桂酸作为该方剂的指标成分，更为适宜。

3.2除杂方法选择在除杂预实验中对醇沉法、静置法、离心法和壳聚糖法进行比较。结果显示静置法和离心法的纯化效果甚微，故不采用。壳聚糖为天然高分子化合物，是一种毒害性极低、可生物降解和生物相容性好的絮凝剂［9］，通过预试验发现：壳聚糖的加入量对絮凝作用是一个先增大后减小的趋势，结合预实验，正交试验设计壳聚糖加入量在1.2～1.6g/L范围内。

醇沉法选取60%、70%、80%3个水平的乙醇体积分数进行试验。与壳聚糖法相比较，在相同杂质去除率时，醇沉法的肉桂酸保留率低于壳聚糖法；同时乙醇沉淀法工艺存在后处理时间长、安全水平低、液体溶剂残留大［10］、产品稳定性差等难题，且整个工艺成本较高［11-12］。从经济效益和生产安全考虑，不采用此法，最终选用壳聚糖对桂附颗粒进行絮凝纯化。从验证试验结果可知，采用壳聚糖除杂工艺对肉桂酸含量的保留率能达到90.88%，杂质去除率达到14.94%，大大降低杂质量的同时，能够极大程度地保留有效成分，降低病人每日服用量，对下一步制粒工艺奠定了试验基础。

综合上述试验，以肉桂酸保留率及杂质去除率综合评分为筛选指标，在前期单因素试验结果的基础上，以正交试验设计的方法优选除杂工艺，得到壳聚糖除杂最佳条件为絮凝温度60℃，药材-药液比1∶[KG-*3/5]7，壳聚糖加入比例1.4g/L，该方法简单可行，能保证药液中肉桂酸高保留率及杂质较高去除率。

桂附颗粒为中药复方制剂，其有效成分具有多靶点、多层次的特点，使用液相色谱仪进行含量测定，对质量控制灵敏、直观［13］。本项目以桂附颗粒的君药有效成分肉桂酸保留率和杂质去除率作为壳聚糖除杂工艺效果的评价指标性，在尽可能保留药效成分的基础上，减少药液中的杂质量以降低患者每日服药量，提升中药制剂临床效果和稳定性，从而减轻患者的使用难度，增加患者依从性，为大生产中除杂提供了数据支持和参考。

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（收稿日期：2023-12-22编辑：陶希睿）

基金项目：2022年泸州市科技计划项目（2022-SYF-92）。

作者简介：许曾（1991—），女，汉族，本科，主管中药师，研究方向为院内制剂研发。E-mail：971586709@qq.com