鹅不食草配方颗粒指纹图谱及一测多评法研究

【摘要】目的：建立鹅不食草配方颗粒指纹图谱检测方法及一测多评含量测定。方法：采用AgilentPoroshell120SB-Aq色谱柱（2.1mm×150mm，1.9μm），乙腈-0.1%磷酸为流动相，梯度洗脱，流速0.2mL/min；柱温为25℃；0～60min检测波长为325nm，60～100min检测波长为225nm。结果：指纹图谱确定26个共有峰，多批次图谱相似度均大于0.9。建立含量测定方法线性范围良好（r2=0.9994～1.000），平均加样回收率99.6%～101.1%建立相对校正因子，通过绿原酸能够准确计算含量，咖啡酸、3，5-二-O-咖啡酰奎宁酸、4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸、3，4-二-O-咖啡酰奎宁酸、隐绿原酸、新绿原酸相对校正因子为1.761、1.387、1.273、0.828、1.141、1.082。结论：本研究制定的方法能作为检测手段简便有效、重复效果好，可为鹅不食草配方颗粒的质量控制和评价提供依据。

【关键词】鹅不食草配方颗粒；指纹图谱；一测多评法；绿原酸

【中图分类号】R284.1

【文献标志码】A【文章编号】1007-8517（2024）18-0027-08

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.18.zgmzmjyyzz202418007

Abstract：ObjectiveToestablishafingerprintdetectionmethodofCentipedaMinimaDispensingGranules（CMDG）formulaparticlesandamulti-evaluationcontentdetermination.MethodsThechromatographywasperformedonAgilentPoroshell120SB-Aqcolumn（2.1mm×150mm，1.9μm）withacetonitrile-0.1%phosphoricacidasmobilephasebygradientelutionattheflowrateof0.2mL/min.Thecolumntemperaturewas25℃.Thedetectionwavelengthof0-60minutesis325nm，andthedetectionwavelengthof60-100minutesis225nm.ResultsThe26commonpeakswereidentifiedbyfingerprint，andthesimilarityofmultiplebatcheswasgreaterthan0.9.Thelinearrangeofthemethodwasgood（r2=0.9994-1.000），andtheaveragerecoveryratewas99.6%-101.1%.Therelativecorrectionfactorsofcaffeicacid，3，5-O-DicaffeoylquinicAcid，4，5-O-DicaffeoylquinicAcid，3，4-O-DicaffeoylquinicAcid，CryptochlorogenicacidandNeochlorogenicacidwere1.761，1.387，1.273，0.828，1.141，1.082.ConclusionThemethoddevelopedinthisstudycanbeusedasasimpleandeffectivedetectionmethodwithgoodrepeatability，andcanprovideabasisforthequalitycontrolandevaluationofCMDG.

Key wMGezuHhobkptLpC7UzuD46/1h2oo0ynrsIDb3lLiIw4=ords：CentipedaMinimaDispensingGranules;Fingerprints;QAMS;ChlorogenicAcidEtc

鹅不食草为菊科植物鹅不食草Centipedaminima（L.）A.Br.EtAschers.的干燥全草［1］。用于风寒头痛，咳嗽痰多，鼻塞不通，鼻渊流涕［2-6］。鹅不食草中分含有酚酸类、黄酮类、萜类、挥发性成分等［7-10］。配方颗粒以传统中医药煎为基础研究供临床使用的单味药颗粒剂，遵循中医辨证论治，保持原中药的特性［11］。目前鹅不食草配方颗粒剂鲜有文献报道，现有颗粒剂标准中规定了3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、4，5-O-二咖啡酰基奎宁含量。中药所含组分复杂［12-13］，简单含量检测方法无法满足中药现代化检测要求。本研究将指纹图谱方法与一测多评方法（QAMS）相结合，同时测定鹅不食草配方颗粒剂中7个有机酸类成分，客观评价不同批次间的品质差异，同时节省检测成本［14-15］。以期为鹅不食草配方颗粒中药现代化的质量控制与评价提供参考。

1仪器与试药

WatersH-Class型超高液相色谱仪；XSR304型电子天平（METTLER-OLEDO仪器公司）；KQ500DE超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；ULUPURE超纯水仪器。18批鹅不食草配方颗粒（批号：1605001W、1609001W、1701001W、1702001W、1708001W、1710001W、1806001W、1805001W、1806001W、1909001S、1806001S、1911001W、2003001W、2005001W、2007001W、2007001S、2108001S、2109001S）；乙腈（色谱纯），默克股份有限公司；其他试剂均为分析纯。

对照品成分代号及信息见表1。

2方法与结果

2.1色谱条件采用AgilentPoroshell120SB-Aq色谱柱（2.1mm×150mm，1.9μm），流动相A为乙腈、B为0.1%磷酸，按照程序进行洗脱（0～15min，3%A→8%A；15～20min，8%A→12%A；20～50min，12%A→20%A；50～60min，20%A；60～70min，20%A→25%A；70～90min，25%A→30%A；90～100min，30%A→35%A），流速为每分钟0.2mL；柱温为25℃；0～60min检测波长为325nm，60～100min检测波长为225nm，进样量1μL。

2.2对照品溶液制备取对照品适量，精密称定，转移至容量瓶里，加甲醇制成每1mL各含50μg的溶液。

2.3供试品溶液制备取鹅不食草配方颗粒研成粉末，取约0.4g，精密称定，放进三角锥形瓶中，精密移取50%甲醇25mL加入样品里面，称定重量，超声处理（功率200W，频率53kHz）30min，放冷，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4指纹图谱的建立

2.4.1精密度试验取同一制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测得各峰的相对峰面积和相对保留时间RSD均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.4.2稳定性试验取同一制备供试品溶液，分别于0h、2h、8h、10h、12h、24h进样测定，测得各峰的相对峰面积和相对保留时间RSD均小于3%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.4.3重复性试验取按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，进样测定，测得共有峰的相对峰面积和相对保留时间RSD均小于3%，表明该方法重复性良好。

2.5指纹图谱分析与评价

2.5.1样品测定取18批鹅不食草配方颗粒样品按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定进样测定，记录UPLC图谱。

2.5.2指纹图谱建立采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012.0版），18批鹅不食草配方颗粒结果图谱以S1图谱作为参照图谱，采用中位数对照谱图生成法，时间窗宽度设为0.1，多点校正，全谱峰匹配，生成指纹图谱共有模式，计算相似度结果。标定共有峰26个。以峰9（绿原酸）为参照峰S1峰，计算峰1～峰8、峰10～峰12的相对保留时间；峰18（3，5-二-O-咖啡酰奎宁酸）为参照峰S2峰，计算峰13～峰17、峰19～峰22相对保留时间；峰26（短叶老鹳草素A）为参照峰S3，计算峰23～峰25的相对保留时间，计算18批鹅不食草配方颗粒各特征峰相对保留时间为0.01%～0.80%，由此可见，建立的特征图谱各特征峰出峰时间较稳定。18批次鹅不食草配方颗粒与对照图谱R的相似度为0.952～0.997，均大于0.900，如图1、图2及表2所示。该图谱可做为鹅不食草配方颗粒的指纹图谱。

2.5.3化学成分指认对供试品溶液和对照品溶液进行检测，将对照品保留时间与供试品保留时间等信息进行比对分析，一共确定12个已知成分，分别为XL（峰5）、KS（峰7）、YL（峰8）、LS（峰9）、LD（峰14）、SN（峰16）、YB（峰17）、YA（峰18）、YC（峰20）、SZ（峰24）、XS（峰25）、DA（峰26）。对照品及供试品色谱定位图如图3所示。

2.6QAMS法测定指标成分含量

2.6.1色谱条件及供试品溶液制备同“2.1”“2.3”项下。

2.6.2线性关系考察分别精密称取LS、KS、XL、YL、YB、YC、YA对照品10.133mg、10.231mg、10.556mg、11.566mg、12.843mg、10.433mg、10.074mg分别放进容量瓶内，加入少量甲醇使溶解后，定容至刻度，作为对照品贮备液。取10mL容量瓶，分别精密吸取0.01mL、0.1mL、1mL、2mL、5mL上述对照品液放入，并定容，即得线性溶液。将上述溶液进行测定，记录检测结果，以峰面积和对照品浓度（μg/mL）来计算回归方程及线性范围，见表3。

2.6.3精密度试验分别精密吸取同一供试品溶液，重复进样6次，计算LS、KS、XL、YL、YB、YC、YA面积RSD，结果分别为0.13%、1.90%、0.93%、0.32%、0.28%、0.12%、0.20%，表明仪器的精密度良好。

2.6.4稳定性试验分别精密吸取同一供试品溶液，分别于0h、2h、8h、10h、12h、24h进样测定，计算LS、KS、XL、YL、YB、YC、YA峰面积RSD，结果分别为0.35%、1.02%、0.93%、0.32%、0.51%、0.32%、0.43%，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.6.5重复性试验按“2.3”项下方法制备供试品溶液6份，计算LS、KS、XL、YL、YB、YC、YA含量RSD，结果分别为1.13%、0.96%、0.48%、1.30%、1.11%、1.19%、1.56%，表明方法的重复性良好。

2.6.6加样回收率试验取已知含量的鹅不食草配方颗粒0.2g，共9份，精密称定，置具塞锥形瓶中，每组分别加入LS、KS、XL、YL、YB、YC、YA对照品溶液，加入量为鹅不食草配方颗粒中各成分含量的50%、100%和150%，制备供试品溶液进行测定，计算LS、KS、XL、YL、YB、YC、YA结果见表4。

2.6.7相对校正因子计算计算各目标成分的相对校正因子，根据公式f=W/A，以绿原酸为内参物质，根据公式fis=fi/fs=（Ai/Wi）/（As/Ws），确定相对校正因子，f为绝对校正因子，W为质量浓度，A为峰面积，fi为内参物i的绝对校正因子，fs为待测物s的绝对校正因子，Wi为内标质量浓度，Ai为内标峰面积，Ws为待测物质量浓度，As为待测物峰面积［15］。

取“2.5.2”项下对照品溶液，进行测定，以绿原酸为内参物，根据公式分别计算LS、KS、XL、YL、YB、YC、YA的相对校正因子，结果见表5。

2.6.8相对校正因子重现性考察分别精密吸取同一供试品溶液，考察不同耐用性条件的影响，结果见表6。

2.6.9待测色谱峰定位采用待测成分与绿原酸保留时间的相对值作为定位标准，计算不同耐用性条件下的LS、KS、XL、YL、YB、YC、YA酸的相对保留时间，结果各待测成分保留时间RSD均小于3%，表明重现性较好，见表7。

2.6.10QAMS法与外标法测定结果比较取18批鹅不食草配方颗粒样品，进行检测，分别采用外标法和相对校正因子进行计算LS、KS、XL、YL、YB、YC、YA的含量。结果表明，用两种不同的检测方法进行计算测得实测值无明显不同，见表8。

3讨论

3.1流动相的选择本研究比较不同浓度的磷酸0.01%、0.02%、0.05%、0.1%、0.2%、0.4%。0.01%、0.02%磷酸条件下，部分色谱峰重叠，分离度较差。在0.1%磷酸至0.4%磷酸之间体系下考察，同时测定各成分含量。结果显示各特征峰基线分离度较好，峰型较好，出峰顺序一致。该方法重现性良好，且适用于含量测定。出于对仪器及色谱柱的保护，因此选定浓度相对较低的0.1%磷酸作为流动相进行洗脱。

3.2检测波长的选择采用PDA检测器在进行全波长扫描，0～60min中7个成分最大吸收波长存在一定差异，在325nm指标成分色谱峰响应值较高，且各特征峰之间分离度较好。故选择325nm下检测LS、KS、XL、YL、YB、YC、YA。60～100min多为萜类成分，在检测波长为225nm下响应较好，基线较平，杂峰较少。结合含量测定方法。最终确定0～60min检测波长为325nm，60～100min检测波长为225nm。

3.3耐用性考察的选择本研究考察了考察柱温（23℃、25℃、27℃）、流速（0.19mL/min、0.20mL/min、0.21mL/min）对色谱分离的影响。不同柱温条件下，各特征峰相对保留时间RSD值范围为0.01%～1.71%，不同流速条件下，各特征峰相对保留时间RSD值范围为0.01%～2.49%，该方法对不同柱温、流速具有良好的耐用性。

根据文献［7-8，13-18］报道，目前各产地市售鹅不食草药材有机酸、黄酮等成分的含量差异较大，由此会导致鹅不食草配方颗粒质量存在的差异。采用外标法及QAMS法对样品进行检测结果平均偏差为0.01%～3.88%，18批次样品的含量显示（见表9），鹅不食草颗粒中各批次成分含量差异较大，本研究所建立的鹅不食草QAMS方法能够有效对成分进行检测，并能够有效对颗粒质量进行控制。鹅不食草对照指纹图谱是以18批鹅不食草配方颗粒拟合建立的，共标定26个共有特征峰，相对保留时间RSD值0.01%～0.80%，各图谱相似度均大于0.9。说明该指纹图谱具有对照意义，专属性强，这对于鹅不食草配方颗粒质量的有效控制及合理应用都具有一定的意义。

鹅不食草配方颗粒指纹图谱及QAMS方法采用现代科技手段进行质量控制。两种方法的结合能够简化检测，节约时间、利益成本。为鹅不食草配方颗粒中药现代化产业标准控制提供了研究依据，对药品质量起到标准化、规范化、客观化描述和评价。

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（收稿日期：2023-12-15编辑：刘斌）

基金项目：深圳市科技计划项目（JSGG20191129093418578）。

作者简介：李璐（1993—），男，汉族，硕士，助理工程师，研究方向为中药饮片及中药配方颗粒研究。E-mail：LILU210@999.com.cn

通信作者：江斌（1989—），男，侗族，硕士，主管中药师，研究方向为中药饮片及中药配方颗粒研究。Email：JIANGBIN51@999.com.cn