健脾益智法调控CXCL1/CXCR2通路介导中性粒细胞局部浸润促进MCAO大鼠轴突再生机制研究

【摘要】目的：研究健脾益智法对MCAO大鼠大脑皮质层和海马区中性粒细胞浸润情况、脑组织中CXCL1、CXCR2表达水平及轴突再生情况，探讨脾脑相关理论的微观机制。方法：将20只SD大鼠按照随机数字表法分为正常组、模型组、中药组，除正常组外，其余两组参照国外学者Zea Longa的线栓法建立MCAO大鼠模型，造模成功后中药组给予健脾益智汤连续灌胃，各组分别于术后7 d、14 d采用醋酸AS-D萘酚酯酶组织化学染色检测大鼠大脑皮质及海马中性粒细胞浸润情况，免疫荧光进行脑组织中CXCL1、CXCR2表达水平及轴突再生情况检测。结果：中药组术后7d、术后14d大鼠大脑皮质层和海马区中性粒细胞数量与同期模型组、正常组比较显著减少，中药组术后7 d、14d、CXCL1和CXCR2表达量均较模型组明显增高。与模型组比较，中药组术后7 d、14 d轴突再生明显，术后14 d尤甚。结论：健脾益智法可能激活CXCL1/CXCR2通路，促进轴突再生，从而修复受损的神经。

【关键词】健脾益智法；中性粒细胞；CXC趋化因子受体2（CXCR2）；CXC趋化因子配体1（CXCL1）；CXCL1/CXCR2；轴突再生

【中图分类号】R285.5

【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2024）18-0016-06

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.18.zgmzmjyyzz202418005

Abstract：Objective To study the neutrophil infiltration in the cerebral cortex，CXCL1and CXCR2 expression levels and axonal regeneration in MCAO rats，and to investigate the microscopic mechanism of spleen and brain.Methods 20 SD rats are divided into normal group，model group，Chinese medicine group，except normal group，the rest two groups by foreign scholars Zea Longa MCAO rat model，mold after successful traditional Chinese medicine group give spleen puzzle soup continuous gastric，each group in 7 days，14 days respectively using acetate AS-D naphthol esterase histochemical staining to detect the infiltration of rat cerebral cortex and hippocampus，immunofluorescence for CXCL1，CXCR 2 expression level and axonal regeneration.Results The number of neutrophils in the cerebral cortex and hippocampus of 7 and 14 days were significantly decreased compared with the concurrent model group; CXCL 1 and CXCR 2 at 7 and 14 days were significantly higher compared with the model group.Compared with the model group，axon regeneration was obvious in 7 days and 14 days after surgery，especially in 14 days after surgery.Conclusion The method may activate CXCL1/CXCR 2 pathway and promote axon regeneration to repair the damaged nerves.

Key words：Spleen Puzzle Method；Neutrophile Granulocyte；CXCR2；CXCL1；CXCL1/CXCR2；Axon Regeneration

缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）是一种具有高死亡率、高致残率、高复发率的高危性急性脑血管疾病，其预后与神经功能缺损程度相关［1-4］。中枢神经损伤后轴突再生失败将会致使永久性残疾，因而轴突再生对神经功能恢复有着重要作用［5］。促进神经再生，改善神经功能是治疗IS的关键。近年来，有研究［6］报道肠道菌群可能通过免疫介导机制影响中风结局，有望成为治疗IS的新靶点。有研究［7］发现趋化因子及其受体结合可以广泛作用于组织炎症、损伤修复等方面，其中趋化因子CXCL1（C-X-C motif Chemokine Ligand 1）/CXCR2（C-X-C Motif Chemokine Receptor 2）在轴突形态发生及神经系统中有着重要作用。最新研究［8］表明间歇禁食可促进坐骨神经挤压损伤的神经轴突再生，其主要机制是间歇禁食后，肠道革兰氏梭菌产生的代谢物吲哚-3-丙酸（indolepropionic acid，IPA）增加，上调了Cd177（中性粒细胞配体）和CXCL1（内皮中性粒细胞趋化因子配体1）的表达，并通过CXCR2介导的机制促进中性粒细胞趋化，从而起到促进轴突再生的作用。中医药对治疗神经功能缺损疾病具有较好疗效。本课题组前期动物实验研究［9-13］结果表明健脾益智法可通过诱导轴突再生改善脑缺血状态，但其机制未明。基于此，本实验建立大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠模型，观察健脾益智胶囊对MCAO模型大鼠大脑CXCL1、CXCR2、中性粒细胞表达的影响及轴突再生情况，探讨其对脑缺血后神经再生机制，从微观层面丰富脾脑相关理论，为临床治疗IS提供新的治疗靶点及实验依据。

1材料与方法

1.1实验动物及分组选取SPF级健康SD雄性大鼠20只，13周龄，体重280～300 g，由上海斯莱克实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（沪）2017-0005。所有大鼠均饲养于福建中医药大学旗山校区实验动物中心屏障内环境，温度20～26 ℃，湿度40%～70%，自由饮食水。适应性喂养6 d后，随机分为正常组（即空白对照组）、模型组、中药组。剩下每组MCAO术后按存活时间分为以下各亚组：术后7 d、术后14 d。每亚组各3只。死亡、造模不达标者随机补足。所有研究均按照福建中医药大学动物伦理委员会、动物实验中心（批准号：2021055）的方案和指南进行。

1.2主要试剂与仪器大鼠线栓（广州佳灵生物科技有限公司，批号：l3800）；CXCL1（武汉三鹰，批号12335-1-AP）；CXCR2（北京博奥森生物技术有限公司，批号bs-1629R）；TAU（武汉三鹰，批号10274-1-AP）；封闭液——浓缩型正常山羊血清（批号AR1009），抗原修复液——EDTA抗原修复液（10X）（批号AR0023），抗体稀释液（批号AR1016），PBS漂洗液（批号AR0030），荧光（DyLight 488）标记羊抗小鼠IgG（批号BA1126），DAPI染色液（批号AR1176），抗荧光淬灭封片剂（批号AR1109），均购自武汉博士德生物工程有限公司；α-乙酸萘酚酯酶染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：G2400）；10%水合氯醛；HM315R石蜡切片机、STP-120全自动生物组织脱水机、EC-350生物组织包埋机、摊片机、烤片机均为德国MICROM；BX51T-PHD-J1三目显微镜 ［奥林巴斯（中国）有限公司］。

1.3药物健脾益智汤由黄芪20 g、制何首乌15 g、人参10 g、白术10 g、远志6 g、菖蒲6 g、水蛭3 g组成。中药饮片均购自福建中医药大学国医堂。加入适量蒸馏水按照浸泡1 h-煎煮2次-混合药液-过滤-浓缩的方式加工，最终制备成1 mL药液含原生药1 g的健脾益智汤。采用灌胃给药方式，剂量均按临床成人剂量的6倍计算收集标本，为7.0 g/（kg·d）。

1.4MCAO模型复制与给药大鼠术前12 h禁食禁水，参照国外学者Zea Longa的方法复制模型，用10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，并将其固定于实验台上，颈部常规备皮消毒，在颈部正中切口依次剪开皮肤、肌肉、筋膜，向深部游离直至暴露左侧胸锁乳突肌和颈前部肌群，从左侧胸锁乳突肌与颈前部肌群向深部分离即可达到颈总动脉，游离左侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）、颈内动脉（internal carotid artery，ICA）、颈外动脉（external carotid artery，ECA）。结扎CCA近心端及ECA，在CCA近分叉处用眼科剪剪一小口，将线栓（佳灵：L3800）从颈总动脉主干切口缓慢向颈内动脉入颅方向推进，以CCA分叉处为标记，推进18～20 mm左右感到轻微阻力时停止，扎紧并固定尼龙线，缝合皮肤。正常组不予任何处理。

术后2 h，依据Longa神经功能评分结果进行模型评价，2分以上的大鼠纳入研究，死亡不足者随机补充。中药组予健脾益智汤（7.0 g·kg-1·d-1）灌胃。正常组不予处理，正常饲养。此后分别于术后7 d、14 d进行处死取材。

1.5组织标本制备大鼠予10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉，并将其固定于实验台上，进行心脏灌注与固定后将大鼠断头，并迅速取出全脑放置于4%多聚甲醛固定液中，后期进行包埋、切片。

1.6大鼠大脑皮质及海马中性粒细胞浸润情况检测采用醋酸萘酚AS-D酯酶染色试剂盒检测大鼠大脑皮质及海马中性粒细胞浸润情况。操作步骤按试剂盒说明书进行操作。每只大鼠随机选取3张不连续图，在放大600倍下，每张切片在皮质及海马区选取3个不同视野。采用图像分析系统（image J）进行阳性细胞数分析计算。

1.7脑组织中CXCL1和CXCR2蛋白表达情况检测将切片常5777109aff102f7fa912ff45e731b093规脱蜡至水，置于 EDTA 抗原修复液，微波炉中高火加热8 min至沸腾，室温冷却 8 min后，再中高火加热8 min，再自然冷却至室温。滴加山羊血清封闭液（原液用 PBS 按1∶[KG-*3/5]9稀释），37 ℃孵育30 min。甩去多余液体，不洗。做好的实验片重滴加适当稀释的一抗，4 ℃过夜。取出后 37 ℃复温 30 min，PBS（pH 7.2～7.6）洗5 min×3次。滴加 DyLight 555 荧光素标记羊抗小鼠IgG 二抗（稀释比例是 1∶[KG-*3/5]1000）， 37 ℃ 孵育45 min。PBS（pH 7.2～7.6）洗5 min×3 次。进行复染，滴加 DAPI 染色液， 室温孵育 3 min。PBS（pH 7.2～7.6）清洗。最后进行封片，用抗荧光淬灭封片剂封片。荧光显微镜观察结果及拍照。每只大鼠随机选取3张不连续图，在放大200倍下，每张切片选取3个不同视野。采用图像分析系统（image J）进行阳性细胞数分析计算。

1.8轴突再生情况检测除所滴加二抗为DyLight 488荧光素标记羊抗小鼠IgG（稀释比例是 1∶[KG-*3/5]1000）外，其余步骤均同1.7所述。使用共聚焦显微镜采集图像，观察大鼠缺血侧大脑神经元轴突再生情况，每只大鼠随机选取3张不连续图，在油镜下放大63倍，每张切片选取3个不同视野。采用图像分析系统（image J）进行阳性细胞数分析计算。

1.9统计学方法采用SPSS 22软件统计分析，实验数据用（x±s）表示，两组间比较用和t检验，多组间比较作单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1健脾益智汤对大脑皮质中性粒细胞阳性细胞数的影响如图1和表1，α-NAE染色显示：大脑皮质层中性粒细胞细胞质呈棕黑色，细胞核呈绿色。与正常组比较，模型组7 d和14 d阳性细胞数显著增多，以模型7 d组尤甚，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与模型7 d和14 d组比较，治疗7 d和14 d的阳性细胞数显著减少，以治疗14 d组尤为明显，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

2.2健脾益智汤对大脑海马中性粒细胞阳性细胞数的影响如图2和表2，α-NAE染色显示：大脑海马区中性粒细胞细胞质呈棕黑色，细胞核呈绿色。与正常组比较，模型组7 d和14 d阳性细胞数显著增多，以模型7 d组尤甚，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与模型7 d和14 d组比较，治疗7 d和14 d的阳性细胞数显著减少，以治疗14 d组尤为明显，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3健脾益智汤对大脑组织CXCL1蛋白的的影响如图3，与正常组比较，模型组7 dCXCL1蛋白表达显著增强，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与模型7 d组比较，治疗7 d和14 dCXCL1蛋白表达显著增强，以治疗14 d组尤为明显，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与模型14 d比较，治疗7 d和14 dCXCL1蛋白表达显著增强，以治疗14 d组尤为明显，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

2.4健脾益智汤对大脑组织CXCR2蛋白的的影响如图4。与正常组比较，模型7 d组CXCR2蛋白表达显著增强，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与模型7 d组比较，治疗7 d和14 dCXCR2蛋白表达显著增强，以治疗14 d组尤为明显，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与模型14 d比较，治疗7 d和14 dCXCR2蛋白表达显著增强，以治疗14 d组尤为明显，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

2.5健脾益智汤对轴突再生的影响如图5。与正常组比较，模型组7 d组轴突增生明显，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与模型7 d组比较，治疗7 d和14 d轴突显著增生，以治疗14 d组尤为明显，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

3讨论

目前缺血性脑卒中仍无较为有效治疗手段，卒中后大部分患者有着不同程度的神经功能缺损，遗留的后遗症给不少家庭带来了沉重的负担。改善神经功能，促进神经再生是现下所被认可的有效治疗方法。调节肠道菌群对于改善缺血性脑卒中有一定的帮助，并且可以通过免疫介导机制影响中风结局，是治疗缺血性脑卒中的新靶点。间歇禁食可以促进神经轴突再生，主要机制正是与肠道菌群有关。间歇禁食可以促进坐骨神经挤压损伤的神经轴突再生，其主要机制是间歇禁食后，增加了肠道革兰氏梭菌产生的代谢物吲哚-3-丙酸（IPA），从而上调了Cd177（中性粒细胞配体）和CXCL1（内皮中性粒细胞趋化因子配体1）的表达，并通过CXCR2介导的机制促进中性粒细胞趋化，进而起到促进轴突再生的作用。

CXCL1（C-X-C motif chemokine ligand 1）属于CXC趋化因子家族，CXC受体2（CXC receptor 2，CXCR2）属于G蛋白偶联受体家族，CXCL1/CXCR2通路可趋化中性粒细胞到达损伤或感染的部位，在机体炎症反应期表达增加，既可促进炎症过程，又可参与伤口愈合，其对于轴突形态与神经系统有着重要作用［7］。

中医药对于改善缺血性脑卒中疗效明确，健脾益智法是基于“脾脑相关”理论所提出的治法，经临床及实验验证对治疗缺血性脑卒中明确有效。在本研究中，中药组术后7d、术后14d大鼠大脑皮质层和海马区中性粒细胞数量与同期模型组比较显著减少，考虑中性粒细胞经趋化到达缺血灶参与损伤修复，由此损耗一部分中性粒细胞，且中药具有抗炎作用，也会损耗一定数量中性粒细胞。中药组术后7 d、14 d CXCL1和CXCR2表达量均较模型组明显增高。与模型组比较，中药组术后7 d、14 d轴突再生明显，术后14 d尤甚。由此推测经健脾益智法治疗后很有可能激活CXCL1/CXCR2通路，促进轴突再生，从而修复受损的神经。本研究仅检测了MCAO大鼠大脑皮质层及海马区中性粒细胞数量，脑组织中CXCL1、CXCR2表达量及轴突再生情况，初步证明健脾益智法可能通过调控CXCL1/CXCR2通路促进轴突再生，从而修复受损神经，尚不能完全阐明健脾益智法治疗缺血性脑卒中的机制，下一步课题组将进一步研究检测IPA表达情况，并积极寻找CXCL1/CXCR2的下游信号通路变化情况以明确健脾益智汤作用于缺血性脑卒中的机制。

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（收稿日期：2024-01-19编辑：刘斌）

基金项目：

国家自然科学基金面上项目（No.81373528）；福建省自然基金面上项目（No.2020J01737，No.2020J01739，No.2022J01873）；福建中医药大学校管课题（X2021001-重点）。

作者简介：游雪娟（1993—），女，汉族，硕士，主治医师，研究方向为中医脾胃方向。E-mail：2582007124@qq.com

通信作者：冯珂（1983—），女，汉族，博士，副教授，研究方向为中医藏象（脾胃）研究。E-mail：905765465@qq.com