掺Mg2+的ZIF-8材料的制备及抗菌和促成骨性能研究

摘要：金属有机框架材料被广泛应用于种植体、骨修复等医疗领域。选用二甲基咪唑为有机配体，Mg2+、Zn1+为金属结节，通过溶剂热法在室温下成功合成纳米级Mg@ZIF-8有机框架材料。Mg@ZIF-8纳米颗粒为正十二面体结构，粒径为200～400 nm，具有Mg–N、Zn–N、C–N、C=C、C=N、C−H官能团，在酸性微环境下不稳定，以上物理表征与ZIF-8相似。抗菌实验结果表明：随着Mg2+浓度的升高，Mg@ZIF-8对大肠杆菌的抗菌性能逐步提高，而且一定浓度的Mg2+对金黄色葡萄球菌的抗菌性能也有所提高。体外矿化实验表明：Mg2+能够促进钛片表面P、Ca的沉积。Mg@ZIF-8有机框架材料在植入物领域有良好的应用前景。

关键词：Mg2+；ZIF-8；金属有机框架；抗菌；成骨

中图分类号：TG 174文献标志码：A

Preparation of ZIF-8 materials doped with Mg and study on its antibacterial and bone properties

LI Lili，MANG Fengcang，HE Daihua

（School of Materials and Chemistry，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093，China）

Abstract：Metal-organic framework materials are widely used in implants，bone repair and other medical fields.In this study，dimethylimidazole was selected as the organic ligand and magnesium ion and zinc ion were used as metal nodules，and nanoscale Mg@ZIF-8 organic framework materials were successfully synthesized by solvothermal method under room temperature conditions.The nanoparticles have aregular dodecahedral structure，a size of 200-400 nm，Mg–N，Zn–N，C–N，C=C，C=N and C−H functional groups，and are unstable in an acidic microenvironment，and the above physical characteristics are similar to ZIF-8.The results of antibacterial experiments and in vitro mineralization experiments were also carried out，and the results of antibacterial experiments showed that with the increase of magnesium ion addition concentration，its antibacterial performance against Escherichia coli gradually improved，and the antibacterial performance of acertain concentration of Mg2+against Staphylococcus aureus was also improved.In vitro mineralization experiments showed that the addition of magnesium ions could promote the deposition of phosphorus and calcium on the surface of titanium sheets.Mg@ZIF-8 organic framework materials have good application prospects in the field of implants.

Keywords：Mg2+;ZIF-8;metal-organic framework;antibacterial;osteogenesis

金属离子不易产生耐药性，因此选用Zn2+、Mg2+等作为促成骨和抗菌因子来改善钛表面的性能[1-2]。金属有机框架（metal-organic framework，MOF）材料是抗菌及骨再生应用中有效的表面改性剂[3]。基于Zn2+的MOF材料在体外和体内具有低毒性或无毒性[4]。Zn-MOF材料在分解过程中会释放Zn2+和有机配体。一方面，Zn2+能促进BMSC的成骨分化[5]，增加成骨细胞的胶原蛋白分泌和钙沉积，促进骨形成[6]，抑制破骨细胞进行骨吸收[7]；另一方面，有机配体也对成骨因子表达有积极作用[8]。

ZIF-8具有药物递送[9]、可持续释放药物、pH响应[10]的能力，在酸性环境下释放Zn2+，从而达到抗菌[11]、促进成骨细胞分化[12-14]。与其他多孔生物材料相比，ZIF-8具有可控且更经济的合成、优异的热稳定性、化学稳定性[15]及良好的生物相容性[16]等优点。Chen等[17]在多孔钛表面制备了由纳米尺度和微米尺度的沸石咪唑盐框架-8（ZIF-8）晶体组成的Zn基MOF膜，其纳米ZIF-8膜不仅增强了MG63细胞中碱性磷酸酶（ALP）活性、细胞外基质矿化和成骨基因（ALP，Runx2）的表达，还抑制了变形链球菌的生长。

Mg2+作为一种良好的生物金属元素，具有优异的抗菌、抗炎性能和促成骨性能，被广泛用于医疗领域[18]。Kang等[19]利用Mg2+的成骨性能，合成了一种外泌体功能化的无细胞PLGA/Mg-GA MOF（PLGA/Exo-Mg-GA MOF）支架，该支架可以同时增强成骨、血管生成和抗炎能力。

为了进一步提高ZIF-8的抗菌性及促成骨活性，本实验提出将Mg2+掺杂到ZIF-8中，合成Mg@ZIF-8纳米颗粒。实验选用Mg（NO3）2·6H2O作为Mg2+源，在低温下合成Mg@ZIF-8，探究Mg2+浓度对ZIF-8的影响，并通过抗菌实验、体外矿化实验研究Mg@ZIF-8的抗菌性及促成骨性能。

1实验方法

1.1材料与设备

用于制备ZIF-8及Mg@ZIF-8的试剂为Zn（NO3）2·6H2O、二甲基咪唑、Mg（NO3）2·6H2O、去离子水、无水乙醇、氢氧化钠等，均为分析纯。测试设备有：扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）、能谱仪（energy disperse spectroscopy，EDS）、X射线衍射仪（X-ray diffractometer，XRD）、傅里叶红外光谱仪（Fourier transform infrared spectrometer，FT-IR）、电感耦合等离子体光谱仪（inductively coupled plasma atomic emission spectrometer，ICP-AES）。

1.2制备方法

1.2.1 Mg@ZIF-8的制备

采用溶剂热法制备Mg@ZIF-8。称取一定量二甲基咪唑、Zn（NO3）2·6H2O、Mg（NO3）2·6H2O粉末，分别加入去离子水并搅拌均匀，配成一定比例的溶液，Mg2+、Zn2+、二甲基咪唑的原子分数比分别为0.5：1：70、1：1：70、1.5：1：70、2：1：70。将配置好的二甲基咪唑溶液倒入不同浓度的Mg（NO3）2·6H2O溶液中反应5～10 min，然后再将混合溶液倒入Zn（NO3）2·6H2O溶液中反应5～10 min，得到Mg@ZIF-8溶液。将Mg@ZIF-8溶液以8000 r/yyPpQcvKD5hvli756plAtQ==min的转速离心，在80℃干燥一夜后可得Mg@ZIF-8固体粉末，样品记为Mg1@ZIF-8、Mg2@ZIF-8、Mg3@ZIF-8、Mg4@ZIF-8。

1.2.2 Mg@ZIF-8@AHT的制备

将碱热处理后的钛片表面清洗干净，用无水乙醇、去离子水超声清洗各3次，每次15 min。将碱热处理后的钛片浸泡在不同Mg2+浓度的Mg@ZIF-8溶液中15 min后取出，低温烘干，得到表面附着Mg@ZIF-8的钛片，即Mg@ZIF-8@AHT。样品制备流程图见图1。

1.3样品表征

利用SEM和EDS对Mg@ZIF-8进行表征，分析其表面形貌及成分；利用XRD分析Mg@ZIF-8的结构特征，扫描速率为3（°）/min，扫描角度2θ为5°～50°;选用FT-IR分析Mg@ZIF-8的官能团，波长为400～4000 cm−1；用界面张力测量仪及配备的数码相机和图像分析软件检测Mg@ZIF-8@AHT的浸润性，滴量为5 μL，间隔时间为10～20 s；采用ICP-AES检测Mg@ZIF-8中Mg2+和Zn2+的释放浓度，将Mg@ZIF-8@AHT标本浸泡在3 mL的磷酸盐缓冲盐水（phosphate buffered saline，PBS）中，在37℃无搅拌条件下分别浸泡6、12、24、48、96 h，并在每个时间点收集渗滤液，用ICP测试滤液中Mg2+和Zn2+的浓度。

1.4抗菌实验

1.4.1细菌培养

选择大肠杆菌（escherichia coli，E.coli，ATCC25922）和金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus，S.aureus，ATCC29215）分别作为革兰氏阴性、阳性细菌的代表，选择LB液体/固体培养基进行培养。

1.4.2抗菌率评价

采用平板计数法来考察各组钛片的抗菌能力，实验步骤如下：

（1）用接种环在大肠杆菌菌板上蘸取部分菌落于50 mL准备好的LB液体培养液中，然后放入37℃振荡培养箱内进行10 h细菌培养。

（2）将测试材料放入孔板中，取1 mL的菌液浸没材料，置于37℃条件下培养24 h。

（3）将离心管、LB琼脂液、枪头等物品进行灭菌处理。

（4）24 h后，取出培养的细菌菌液，用无菌PBS冲洗钛片，去除钛片表面黏附的细菌。在每个孔中加入1 mL的无菌PBS溶液，在超声条件下振荡5 min。

（5）在离心管与LB琼脂板上进行标名后，取悬浮液加入到离心管中，振荡摇匀，稀释菌液。重复多次操作至菌液浓度分别为10−4、10−5、10−6倍。

（6）分别取50 μL上述3种浓度菌液加入到LB琼脂板中进行涂布，每种菌液涂3板。涂布前需对涂布器进行灭菌，且培养皿开口处靠近酒精灯，防止其他细菌进入。

（7）涂布后将LB琼脂板置于37℃的培养箱中进行细菌培养，24h后取出，观察细菌的生长情况与菌落数量。

1.5体外矿化实验

将Mg@ZIF-8@AHT放入20 mL的0.2 mol/L的CaCl2溶液中浸泡3 min，取出后浸入蒸馏水（dH2O）中5 s；再放入烘箱中干燥3 min；烘干后置于20 mL的0.2 mol/L的K2HPO4溶液中浸泡3 min后取出；浸入dH2O中5 s；再放入烘箱中干燥3 min。以上步骤循环操作3次。

将不同Mg2+浓度的Mg@ZIF-8@AHT装入有40 mL SBF溶液的离心管中，置于37℃恒温培养箱中保存，隔天换液。在3、7 d时间点取样，用dH2O浸泡清洗，以去除在表面结晶的NaCl，放置在空气中干燥。将矿化后的Mg@ZIF-8@AHT作表面喷金处理，置于SEM中进行形貌表征。

2结果与讨论

2.1 Mg@ZIF-8表征

图2为ZIF-8、Mg@ZIF-8、ZIF-8@AHT的SEM图。图2（a）、2（c）中ZIF-8表现为菱形十二面体结

构，尺寸为200～400 nm。图2（c）、2（d）中的ZIF-8已经成功负载到钛片表面的网状结构中。图2（e）、2（f）中Mg@ZIF-8呈菱形十二面体结构，尺寸为200～400 nm，这和ZIF-8结构一致。负载到碱热处理后的钛片上的形貌如图2（g）、2（h）所示，Mg@ZIF-8均匀地附着在钛片表面的网格中。

表1和表2分别是ZIF-8和Mg@ZIF-8的EDS分析结果。从表1中可以看出，ZIF-8中含有C、N、Zn、Au等元素。从表2中可以看出，Mg@ZIF-8中含有C、N、Zn、Mg、Au等元素。EDS检测不出H，有机物可根据C、N两种元素来判别，因此，可判断Mg@ZIF-8是含有有机物、Zn2+、Mg2+的聚合物。根据上述元素分析结果推测，已成功将Mg 2+掺杂到ZIF-8结构当中。由于样品进行了喷金处理，所以导致了Au的出现。

图4（a）为ZIF-8和Mg@ZIF-8的XRD谱图，可以看到，合成的ZIF-8与标准ZIF-8卡片（602542）中的（011）（002）（112）（022）（013）（222）（114）（233）（134）特征峰都能对应，Mg@ZIF-8与ZIF-8的特征峰一致。因此，Mg2+的添加并没有影响ZIF-8的结构。ZIF-8和Mg@ZIF-8的FT-IR光谱图如图4（b）所示，可以看出，ZIF-8在417、1147、1580、1627、2927 cm−1处出现吸收峰，分别对应Zn–N、C–N、C=C、C=N、C−H官能团。Mg@ZIF-8的FT-IR光谱为图4（b）中的蓝线，Mg@ZIF-8在464、631 cm−1处出现两个吸收峰；在3100～3700 cm−1处出现了较宽的吸附峰。464、631 cm−1处的峰是由于Mg（NO3）2·6H2O NP中的Mg–N引起的拉伸振动；3100～3700 cm−1处的吸收峰与-OH基团有关，掺杂Mg2+后的Mg@ZIF-8结构发生变化，有更多的水分子残留在孔道中。

图5（a）是Zn2+在PBS溶液中的释放情况，Zn2+在pH为7.4时缓慢释放，在pH为6.0时的释放速率增大。图5（b）是Mg2+在PBS溶液中的释放情况，Mg2+在pH为7.4时缓慢释放，在pH为6.0时的释放速率增大。Mg@ZIF-8在酸性溶液中Zn2+和Mg2+的释放速率增大，这与MOF材料在碱性环境下稳定、酸性条件下分解的性质一致。

图6是不同浓度的Mg@ZIF-8负载的钛片的浸润性表征分析。从图6中可以看出，掺杂Mg2+后，钛片表面的接触角增大，且随着Mg2+浓度的增加，接触角从8.50°增大到23.75°，这可能是因为随着离子浓度的升高，有机配体和金属离子的比例逐渐升高，引发Mg@ZIF-8纳米粒子尺寸减小，进而导致接触表面更加光滑。

2.2抗菌实验

使用扩散平板法，选用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌来评估样品的抗菌性能。不同样品上的大肠杆菌如图7（a）所示，随着Mg2+浓度的增加，对大肠杆菌的抗菌性也随之增加。大肠杆菌的抗菌率如图7（c）所示，低浓度和高浓度的Mg2+对大肠杆菌的抗菌率分别为2.7%和100%。不同样品上的金黄色葡萄球菌如图7（b）所示，其抗菌率如图7（d）所示，随着Mg2+浓度的升高，Mg@ZIF-8对金黄色葡萄球菌的抗菌率依次为17.3%、43.3%、−14.9%、−25.0%，这可能是因为随着Mg2+浓度的提高，预防了核糖体胁迫下的细菌超极化现象，促进了细菌生长[20]。因此，Mg2@ZIF-8对这两种细菌的抗菌率都有所提升。

2.3体外矿化

图8是ZIF-8@AHT和Mg@ZIF-8@AHT浸泡在SBF模拟体液中3、7 d的表面矿化情况。如图8（a）、8（b）所示，在3 d时，ZIF-8@AHT和Mg@ZIF-8@AHT表面均有结晶沉淀，沉淀首先在ZIF-8、Mg@ZIF-8周围沉积，随着结晶物的堆积最终将ZIF-8和Mg@ZIF-8淹没。图8（c）、8（d）为矿化后的各元素的含量，矿化3d后，Mg@ZIF-8@AHT表面结晶沉积物中Ca含量更高，原子分数为21.27%；矿化7 d后Mg@ZIF-8@AHT中Ca含量明显上升，原子分数为51.64%，且Ca含量已经超过Zn含量，说明有源源不断的Ca、P离子从SBF模拟体液中析出，沉积在矿化位点或已形成的钙磷沉积上。因此，Mg@ZIF-8可诱导钙磷在晶体结构内均匀沉积，随着时间的延长，形成的混合矿化物出现团聚、变大等现象。

3结论

本文主要通过溶剂热法制备出了具有纳米尺寸的MOF材料Mg@ZIF-8，并对其抗菌和促成骨性能进行了研究，主要结论如下：

（1）Mg@ZIF-8呈正十二面体结构，尺寸为200～400 nm，具有和ZIF-8相似的框架结构及官能团，在酸性条件下框架解体，离子释放速率加快。将Mg@ZIF-8加载到钛片表面后接触角从8.50°增大到23.75°，整体亲水性变化不大。

（2）与ZIF-8相比，Mg@ZIF-8对大肠杆菌的抗菌性增强，且随Mg2+浓度的增加，抗菌率从2.7%增加到100%；少量的Mg2+掺杂对金黄色葡萄球菌的抗菌性能也有所提高，Mg2@ZIF-8对金黄色葡萄球菌的抗菌率提升最显著，为43.3%。

（3）与ZIF-8相比，Mg@ZIF-8的Ca沉积性能增强，矿化3 d后Ca的质量分数从14.89%增加到21.27%，矿化7 d后Ca的质量分数从47.76%增加到51.64%。

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（编辑：毕莉明）