采用高效液相色谱法同时测定醋延胡索中延胡索乙素和延胡索甲素的含量

【摘要】目的：开发一种高效液相色谱法（HPLC）同时测定醋延胡索中延胡索乙素和延胡索甲素的含量。方法：采用HPLC法，色谱柱选用Kromasil 100-5-C18柱，流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺调pH值至6.0）（55∶45），流速：1.0 mL·min-1，波长：280 nm下检测，柱温：30℃。结果：在该色谱条件下，两个对照品均达到基线分离，线性关系良好（r>0.9995，n=5）；平均加样回收率为96.90%～ 100.05%，RSD为0.7%～1.9%。结论：该检测方法简便、灵敏、稳定、可靠，可作为醋延胡索的质量控制方法之一。

【关键词】醋延胡索；高效液相色谱；延胡索乙素；延胡索甲素

【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.05.012

【基金项目】浙江省药品监管系统科技计划项目（2022021）。

Simultaneous Determination of Tetrahydropalmatine and Corydaline in Vinegar-steamed Corydalis Rhizoma by HPLC

WANG Weiqian1， LYU Linfeng2， JIANG Yonghai1， XIE Zheyu1， ZHONG Ningyuan1*

（1.Shaoxing Institute for Food and Drug Control， Shaoxing 312071， China； 2.Shaoxing Zhenyuan Traditional Chinese Medicine Decoction Pieces Co.， Ltd.， Shaoxing 312000， China）

Abstract： Objective： To develop a high-performance liquid chromatography （HPLC） method for simultaneous determination of tetrahydropalmatine and tetrahydropalmatine in vinegar yanhusuo. Method： HPLC was used， with Kromasil 100-5-C18 column as the chromatographic column. The mobile phase was methanol 0.1% phosphoric acid solution （adjusted to pH 6.0 with triethylamine） （55： 45）， with a flow rate of 1.0 mL·min-1and detection at a wavelength of 280 nm. The column temperature was 30℃. Result： Under the chromatographic conditions， both control samples achieved baseline separation with a good linear relationship （r>0.9995， n=5）； the average recovery rate was 96.90%～100.05%， and the RSD was 0.7%～1.9%. Conclusion： This detection method is simple， sensitive， stable， and reliable， and can be used as one of the quality control methods for vinegar yanhusuo.

Keywords： vinegar corydalis yanhusuo； HPLC； yanhusuo yi su； yanhusuo jia su

醋延胡索是罂粟科紫堇属植物延胡索的干燥块茎，经切片、加醋炒制后烘干而成的中药[1-2]。成品为不规则的圆形厚片，微具醋香气。醋延胡索的延胡索乙素含量测定已列入《中华人民共和国药典》2020年版第一部中，但现行标准的质控指标较为单一，需要建立较为高效、准确的质量控制方法和标准[3]。

延胡索中的延胡索甲素、延胡索乙素均属于在生源途径中为单一来源的异喹啉类生物碱，可能是其他几种基核结构类型生物碱的前体物质[4]。从成分占有量来看，延胡索甲素、延胡索乙素占比较高，是延胡索的主要成分[5]。综合上述分析，将延胡索的质量指标定为延胡索乙素和延胡索甲素。本研究依据药典标准及相关文献，为了给醋延胡索的质量指标提供检验依据，建立同时测定醋延胡索中延胡索乙素及延胡索甲素含量的高效液相色谱法。

1仪器与试药

1.1仪器

Agilent1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司），FESCO17微量离心机（美国Thermo Fisher公司），XS206十万分之一电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；MILLI-Q ADVANTAGEA10超纯水仪（MILLIPORE）。

1.2试药

10批醋延胡索饮片（S1～S10）；延胡索乙素（中检院，110726-202020，含量99.3%），延胡索甲素（安谱，批号2251578，含量99.2%）；色谱纯甲醇，分析纯的甲酸等试剂，水为超纯水。

1.3中药材的鉴定

样品采自浙江磐安、新昌、诸暨，按《中华人民共和国药典》2020年版第一部，由绍兴市食品药品检验研究院吕林锋副主任中药师进行性状检测，鉴定均为正品延胡索。具体信息见表1。

2方法与结果

2.1对照品溶液的制备

精密称取延胡索乙素和延胡索甲素对照品各10 mg，以甲醇为溶剂稀释，制成质量浓度分别为46μg/mL、50μg/mL的混合对照溶液。

2.2供试品溶液的制备

精密称取醋延胡索粉末（过三号筛）0.5 g，置于烧瓶中，精密吸取50 mL浓氨试液-甲醇（1∶20）混合溶液，先称定重量，经过1 h浸渍后再加热回流1 h，冷却后再称重，用浓氨试液-甲醇（1∶20）混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25 mL，蒸干，加入甲醇溶解残渣，转移至5 mL量瓶中并稀释至刻度，摇匀并滤过，取续滤液，即得。

2.3色谱条件

色谱柱型号：Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×150 mm，5μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（以三乙胺调pH值至6.0）（55∶45）；柱温：30℃；检测波长：280 nm。以延胡索乙素峰计，理论板数不低于3000。

2.4方法学考察

2.4.1系统适用性试验

精密吸取延胡索乙素、延胡索甲素混合对照溶液与醋延胡索供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得，见图1。

2.4.2线性范围考察

用甲醇溶解稀释精密称取的延胡索乙素和延胡索甲素对照品，置于10 mL容量瓶中，摇匀，得对照品储备液，精密量取对照品储备液，分别稀释成质量浓度为0.0092、0.0231、0.0461、0.0923、0.1846 mg/mL的延胡索乙素对照品溶液和质量浓度为0.0108、0.0271、0.0542、0.1083、0.2166 mg/mL的延胡索甲素对照品溶液，注入液相色谱仪，测定含量。以浓度为纵坐标、峰面积为横坐标绘制标准曲线，延胡索乙素：Y=8.6228X-5.7925（r=0.9998），延胡索甲素：Y=7.2178X+10.655（r=0.9995），两个对照品线性关系良好，符合含量测定要求。

2.4.3精密度试验

精密吸取延胡索乙素和延胡索甲素混合对照溶液10μL注入液相色谱仪内，测定平行6次的峰面积，RSD为0.8%（延胡索乙素）、1.0%（延胡索甲素）。结果符合规定，表明仪器具有良好的精密度。

2.4.4重复性试验

精密称取样品0.5 g，依照“2.2”项下方法制备，测定平行6次的含量，计算数据。延胡索乙素的含量为0.071%，RSD为1.5%；延胡索甲素的含量为0.078%，RSD为1.6%。结果符合规定，表明本方法重现性良好。

2.4.5稳定性试验

精密称取样品0.5 g，依照“2.2”项下方法制备，在0、4、8、12、24 h分别测定含量。延胡索乙素的RSD为1.7%、延胡索甲素的RSD为1.0%。结果符合规定，表明24 h内供试品溶液具有良好的稳定性。

2.4.6加样回收率试验

精密称取0.25 g的已知含量样品6份，加入相匹配的对照品，依照“2.2”项下方法制备，同“2.3”项下色谱条件一致，依据峰面积并计算加样回收率，见表2。

2.4.7样品含量测定

参考《中华人民共和国药典》2020年版第一部“醋延胡索含量”项测定10批样品，设定按干燥品计算，延胡索乙素（C21H25NO4）不少于0.040%，延胡索甲素（C22H27NO4）不少于0.030%，见表3。

3结果

3.1指标成分的选择

醋延胡索是延胡索药材经切片后加醋炒制，再烘干而得。参照《中华人民共和国药典》2020年版第一部，仅以延胡索乙素单一成分作为质控指标，不能对药材的整体质量进行综合评定。刘昌孝院士提出了中药质量标志物（quality marker，Marker）概念[6]。延胡索中的主要成分是原小檗碱型生物碱[7]，具有活血、行气、止痛的作用。延胡索甲素和延胡索乙素是其代表成分，从而推断它有可能是另一种具有代表性生物活性的单体，因为延胡索甲素具有类似于延胡索乙素的化学结构。本研究选择了比现有标准更全面地反映醋延胡索内在质量的延胡索甲素作为新含量指标，并建立了对其质量控制有利的 HPLC含量测定法。

3.2检测波长的选择

经紫外吸收及纯度检测对比对照品溶液和供试品溶液，结果表明2个成分均在280 nm有最大吸收波长，同药典中延胡索的定量指标一致，故依旧选择280 nm作为检测波长。

4结束语

本研究建立了高效液相色谱测定方法同时测定醋延胡索中延胡索乙素、延胡索甲素的含量。该方法为醋延胡索质量标准的提升和扩大产业化应用提供了参考依据和实验基础，且具有操作简单、准确实用、结果可靠的优势，有利于深入研究醋延胡索质量控制。

【参考文献】

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：2020年版一部[M].北京：中国医药科技出版社，2020.

[2]林源，魏雨辰，李晓东，等.醋蒸延胡索质量标准研究[J].药学实践杂志，2022，40（1）：57-61.

[3]张铁军，许浚，韩彦琪，等.中药质量标志物（Q-marker）研究：延胡索质量评价及质量标准研究[J].中草药，2016，47（9）：1458-1467.

[4] LISCOMBE D K，FACCHINI P J.Molecular cloning and characterizationoftetrahydroprotoberberinecis-Nmethyltransferase，anenzymeinvolvedinalkaloid biosynthesis in opium poppy[J]. Journal of Biological Chemistry，2007，282（20）：14741.

[5]张铁军，许浚，韩彦琪，等.中药大品种质量标准提升研究的思路与实践[J].天津中医药，2017，34（1）：4-12.

[6]刘昌孝，陈士林，肖小河，等.中药质量标志物（QMarker）：中药产品质量控制的新概念[J].中草药，2016，47（9）：1443-1457.

[7] YANG W，ZHANG Y，WU W，et al.Approaches to establish Q-markers for the quality standards of traditional Chinese medicines[J].Acta Pharmaceutica Sinica B，2017（4）： 439-446.

【作者简介】

王伟倩，女，1993年出生，主管药师，硕士，研究方向为中药检验。通信作者：钟宁远，女，1986年出生，主管药师，硕士，研究方向为质量科技管理，ningyuan_123@163.com。

（编辑：侯睿琪）