基于代谢组学探究虾青素调节对乙酰氨基酚所致小鼠肝损伤的机制

摘要：为了探究虾青素调节对乙酰氨基酚所致小鼠肝损伤，本研究采用非靶向代谢组学方法，从代谢层面揭示虾青素在调节对乙酰氨基酚所致小鼠肝损伤中的途径和机制。通过多种统计分析方法，发现154种代谢物发生了显著的回调现象，鉴定出其中的35种物质在代谢过程中扮演了关键角色。通过对这些代谢物的分析，谷胱甘肽代谢、三羧酸循环、谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、D-谷氨酸和D-谷氨酰胺代谢、嘌呤代谢以及甘油磷脂代谢可能是虾青素调节对乙酰氨基酚所致小鼠肝损伤的主要代谢通路。本研究将有助于解读虾青素调节对小鼠肝损伤的影响机制，后续也为虾青素的深度研究和开发利用提供了一定的理

论基础。

关键词：虾青素；营养强化剂；代谢组学；生物标志物；代谢轮廓分析

虾青素（ASTA）是一种天然存在的类胡萝卜素，主要出现在海洋微生物和动物中[1]。虾青素具有使活性氧化剂失效、消除单线态氧分子、清除活性氧以及阻断氧化连锁反应的重要功能[2]。有研究表明虾青素在减少脂质过氧化、平衡凋亡蛋白表达、抑制促炎细胞因子以及维护肝脏组织学结构方面有着显著效果[3]。药物性肝损伤（DILI）是一种由药物本身或其代谢产物引发的严重肝部损害[4]。在现有的3万多种针对各类疾病的药物中，高达1100种药物都有可能对肝脏造成损伤[5]。尽管乙酰氨基酚（APAP）在治疗剂量下使用是安全的，但在西方国家过量使用APAP导致的急性肝衰竭病例仍然非常普遍[6]。

代谢组学作为一种全面而系统的研究手段，专注于探究生物体内代谢物的动态变化[7]。通过对代谢物开展详尽的定性和定量分析，能够深入揭示代谢网络的结构、代谢通路的走向以及代谢调控的机制，从而进一步理解生物体的生理功能和可能出现的病理状态[8]。为了更深入地理解DILI的发生、发展及其后续的调节机制，需要寻找那些合适的生物标志物[9]。本研究将采用非靶向代谢组学的策略，揭示虾青素在调节对乙酰氨基酚导致的小鼠肝损伤中的具体途径和机制。

1 试验材料

1.1 仪器

Dionex Ultimate 3000 UHPLC Plus（美国Thermo Fisher公司）；LTQ Orbitrap XL质谱仪（美国Thermo Fisher公司）；ACQUITYTM超高效液相色谱（美国waters 公司）；AL104电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；TGL-16台式高速冷冻离心机（广州吉迪仪器有限公司）；NV-15G氮吹浓缩仪（天津津腾实验设备有限公司）；FSH-2高速匀浆机（上海达洛科学仪器有限公司）。

1.2 材料与试剂

对乙酰氨基酚（纯度99.0%，北京华迈科生物科技有限公司）；ASTA对照品（纯度98.0%，Sigma-Aldrich）；ASTA原料药（纯度96.0%，北京华迈科生物科技有限公司）；甲醇（色谱纯，美国Sigma公司）；乙腈（色谱纯，美国Sigma公司）；甲基叔丁基醚（分析纯，天津津东天正）；乙酸乙酯（分析纯，天津津东天正）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

1.3 试验动物

4周龄Kunming种（KM）小鼠300只，雌性和雄性各150只，体重为（21±1）g，由大连医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（辽）2023-0002。

2 试验方法

2.1 LC-MS参数

色谱条件：色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm），流动相乙腈-水，流动相梯度（0～3 min，5%～30%；3～8 min，30%～85%；8～10 min，85%～95%），流速0.2 mL/min，柱温30℃。

质谱条件：电喷雾离子源，正离子模式、负离子模式，干燥气流11 L/min，气体温度350℃，毛细管电压35 V，高分辨（30000）全扫描模式。

2.2 动物试验及生物样品采集

将KM小鼠随机分为4组（n=75），即空白对照组（control，G0）、空白+给予ASTA组（ASTA组，G1）、模型组（APAP组，G2）以及模型+给予ASTA组（APAP + ASTA组，G3），每组中雌、雄个体数相等。G2组及G3组每天通过腹腔注射的方式给予小鼠150 mg/kg·d的APAP溶液，并持续至试验最终阶段。G1组及G3组小鼠分别按100 mg/kg·d灌胃给予ASTA混悬液。G0组腹腔注射、灌胃和G2组灌胃使用等体积生理盐水替代。

分别取第0、1、2、3、4周给药后2 h各组小鼠肝组织匀浆离心液进行分析。取小鼠组织匀浆液250 μL，加入0.25 mL ZnSO4—乙腈混合溶液750 μL（40∶60，v/v），

涡旋混合1 min，离心（16 000 r/min）10 min，转移上清液置另一离心管中，35℃氮气流下挥干，残渣加乙腈200 μL复溶，超声2 min，涡旋振荡30 s，转移至另一离心管中，离心（16 000 r/min）10 min，取上清液进样分析。

2.3 数据处理

利用Analyst TF 1.6软件收集原始数据后，通过python scikit-learn机器学习库对数据进行峰对齐和去噪处理，导出数据矩阵。对数据进行列归一化，不同组别的样本，运用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）进行差异分析。筛选化合物，通过比对在线数据库METLIN和HMDB中的质谱信息来鉴定潜在的生物标志物。使用MetaboAnalyst 4.0在线数据库对检测到的潜在生物标志物进行代谢途径分析以探究相关的生物学机制。

3 结果与分析

3.1 代谢轮廓分析

选取第2周的数据进行非靶向代谢组学实验。对4种实验数据进行PCA分析，在图1中显示各组样本在PC1和PC2维度上表现出较好的分离趋势。值得注意的是，G0组与G1组小鼠得分也出现明显的分离，这可能是因为更换环境饲养、给药及实验环境干扰，使小鼠在一定程度上产生应激，造成一定程度的肝损伤，而因为ASTA的存在使G1组小鼠肝损伤程度较低。

为了使不同组别间的数据实现进一步分离，本试验采用Permutation test和5-fold交叉验证得到模型评价参数R2Y和Q2，结果如图2显示：2条拟合直线的斜率为正，R2Y和Q2的终值分别为0.9989和0.9430，截距分别为-0.58和0.97，说明模型的可解释性和可预测性均良好，模型不存在过拟合现象，可以对未知样品进行预测。

3.2 差异代谢物筛选

通过t检验和VIP火山图分析2种单变量分析方法对G0与G2，G2与G3组间差异进行分析。P＜0.05和VIP＞1的代谢物被认为是对分类有显著贡献的成分，其交集在本实验中被认为是有显著性差异的代谢物，见图3。

结果显示，与G0组相比，在G2组中共发现354个符合上述标准的代谢物，将其整理为数据集D1，其中201种物质上调，153种下调。同样方法分析G2与G3组样品，共发现符合标准的代谢物有326种，将其整理为数据集D2，其中上调的物质有202种，下调的物质有124种。将D1与D2取交集，共得到154种差异代谢物，其中95种上调，59种下调。这说明经过ASTA干预后，其中的154种代谢物发生了回调，表明这些物质与ASTA调节APAP肝损伤作用有关。通过匹配数据库，鉴定出其中的35种物质。通过层次聚类算法对筛选得到的潜在生物标志物进行分析，如图4所示，G0与G2组，G2与G3组能够明显分为2组，说明筛选的显著性差异物质是正确的。

利用MetaboAnalyst 4.0在线网站的pathway analysis模块，基于拓扑分析（x）和富集分析（y）的评分，对筛选出的显著性差异物质进行通路分析。每个圆的颜色和大小分别表示P值和通路影响因子，结果表明，ASTA调节肝损伤作用的主要途径包括谷胱甘肽代谢、三羧酸循环、谷氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸、D-谷氨酸和D-谷氨酰胺代谢、嘌呤代谢和甘油磷脂代谢。

4 讨论与结论

虾青素作为功能性营养强化剂在调节健康方面具有巨大的潜力，但其活性的作用机制尚不明确，阻碍了虾青素相关产品的进一步开发应用。近年来，研究人员证实虾青素在预防急性肝损伤和肝纤维化方面发挥着重要作用。有研究表明虾青素可以通过激活主要影响氧化应激、自噬和铁死亡过程的Nrf2/HO-1途径预防肝损伤，用ASTA治疗后，细胞自噬增强，并抑制了铁死亡，对药物诱导的肝损伤起到缓解和改善的作用[10]。

通过开展小鼠肝组织匀浆液的代谢组学研究，运用多种统计分析方法，发现154种代谢物发生了显著的回调现象。成功鉴定了其中的35种物质，通过对这些代谢物的分析，发现它们主要涉及以下几个主要的代谢通路：谷胱甘肽代谢、三羧酸循环、谷氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸、D-谷氨酸和D-谷氨酰胺代谢、嘌呤代谢以及甘油磷脂代谢。这些代谢通路在维持肝脏正常功能和应对损伤过程中起着至关重要的作用。

参考文献

[1] 肖素荣，李京东.虾青素的特性及应用前景[J].中国食物与营养，2011，17（5）：33-35.

[2] Alessandro M，Mariano I，Daniela P，et al.Astaxanthin as a metabolic regulator of glucose and lipid homeostasis[J].Journal of Functional Foods，2024，112（10）：5937-5939.

[3] 熊章远，张钰婕.虾青素的来源、功能与应用[J].中国食品工业，2024（5）：174-176.

[4] Jaeschke H，Ramachandran A.Acetaminophen

Hepatotoxicity：Paradigm for Understanding Mechanisms of

Drug-Induced Liver Injury[J].Annual review of pathology，2024（19）：453-478.

[5] Lin J Y，Li M，Mak W Y，et al.Applications of In Silico

Models to Predict Drug-Induced Liver Injury[J].Toxics，2022，10（12）：788.

[6] 章越，聂源，朱萱.生物标志物在药物性肝损伤的应用进展[J].安徽医科大学学报，2021，56（4）：663-666.

[7] Elisabeth G，T.L.S.V，Bouwman W，et al.Carbohydrate Content of Diet Determines Success in Type 2 Diabetes Outcomes[J].Metabolism，2021，116（S）：368-372.

[8] 徐杨，何芷绮，刘晓凤，等.代谢组学在中药复方制剂领域的研究进展及面临的挑战[J].中草药，2024，55（4）：1354-1364.

[9] 范琦琦，赵香香，吴鸣，等.代谢组学在谷物食品中的应用研究进展[J].食品工业科技，2024，45（7）：35-43.

[10] 孙泽远，曹建民，胡戈，等.虾青素对递增负荷大强度运动致大鼠肝损伤的保护作用机制[J].营养学报，2021，43（6）：571-576.