高效液相色谱法检测玉米中呕吐毒素方法优化

摘要：在GB 5009.111—2016《食品安全国家标准 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》基础上，采用高效液相色谱法，通过优化样品的前处理过程，旨在建立一种能够快速、准确、大批量检验玉米中呕吐毒素含量的测定方法。结果显示，呕吐毒素在100～5 000 ng/mL的浓度范围内具有较好的线性关系，线性相关系数R2大于0.999 97，方法检出限为18.4 μg/mL，定量限为61.3 μg/mL，样品回收率在90.04%～108.42%，相对标准偏差（RSD）为3.69%～6.70%，符合国标对呕吐毒素的检验要求，满足大规模玉米样品的快速测定。

关键词：玉米；呕吐毒素；高效液相色谱；快速测定

中图分类号：O657.7+2 文献标志码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20240225

Optimization of high performance liquid chromatography for detection of vomitoxin in maize

Wang Yudi， Yue Tingting， Tan Hongbo， Pan Xing

（ Baicheng Grain and Oil Quality Monitoring Center， Baicheng， Jilin 137000 ）

Abstract： On the basis of GB 5009.111—2016 "Determination of deoxynivalenol and its acetylated derivatives in foodstuffs"， high-performance liquid chromatography （HPLC） was used， and by optimizing the pretreatment process of the samples， the aim was to establish an assay method that could rapidly， accurately， and in large quantities test the content of vomitoxin in corn. The results demonstrated that the linear relationship of vomitoxin was good in the concentration range of 100～5 000 ng/mL， with the linear correlation coefficient （R2） greater than 0.999 97. The limit of detection （LOD） of the method was 18.4 μg/mL， the limit of quantification （LOQ） was 61.3 μg/mL， the recoveries of vomitoxin were in the range of 90.04%～108.42%， and the relative standard deviations （RSD） were in the range of 3.69%～6.70%， which ea56c72948692ce5bf09be7fd1beae14complied with the requirements of the national standard for the determination of vomitoxin in corn. It met the requirements for the rapid determination of large-scale corn samples.

Key words： corn； vomitoxinl； high performance liquid chromatography； rapid detection

呕吐毒素（DON），因其分子结构为雪腐镰刀菌烯醇的4-脱氧衍生物，又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇，主要是由禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌产生的真菌毒素[1]，一般污染玉米、小麦、燕麦等粮食作物及其制品和副产品，尤其是对玉米和小麦的污染最为严重，污染地区遍布全球[2-4]。人类和动物食用呕吐毒素超标的产品后容易引起恶心、呕吐、胃部不适、免疫抑制、生殖异常等症状，严重时可危及生命。同时粮食中呕吐毒素的积累不仅对人类和动物造成严重的健康威胁，而且在食品和畜牧业中造成经济损失。因此采用准确、快速、高效的检测方法对粮食中呕吐毒素含量进行监测和管控，对于人类健康和社会经济发展具有重大意义[5]。

目前呕吐毒素的检验方法主要有：液相色谱法（HPLC）[6]、液相色谱-串联质谱法（LC-MS）[7]、薄层色谱法（TIC）[8]、酶联免疫吸附分析（ELISA）[9]、胶体金免疫法[10]、时间分辨荧光免疫层析法[11]等。高效液相色谱技术具有重现性好、灵敏度高、结果准确等优点，相较于液相色谱-串联质谱法技术无法进行多组分同时检测的弊端增加了检验的时间。鉴于高效液相色谱仪在基层实验室的保有率更高，本文在GB 5009.111—2016《食品安全国家标准 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》[12]中第二法“免疫亲和层析净化高效液相色谱法”的基础上，通过优化前处理的过程，建立一个能够在保证检验结果准确性的前提下，缩短检验时间，降低检验成本，简化操作流程，更加适用于日常化验室大批量检验玉米样品中呕吐毒素含量的测定方法，以期为粮食检验监测部门提供切实有效的检验方法与数据。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

呕吐毒素免疫亲和柱：北京中检维康生物技术有限公司；甲醇（色谱级）：德国默克公司；超纯水：用Milli-Q超纯水机实验室制得；有机微孔滤膜（0.45 μm）：天津津滕中国有限公司；聚乙二醇：上海麦克林生化科技有限公司；乙腈中呕吐毒素标准物质GBW（E）100394（100.7 μg/mL）：国家粮食和物资储备局科学研究院；玉米阴性样品：实验中留存；呕吐毒素成分分析质控样品（400、800 μg/kg）：国家粮食和物资储备局科学研究院。

1.2 仪器与设备

LC-2010型高效液相色谱仪配紫外检测器：日本岛津公司；LD210-2型电子天平：沈阳龙腾电子有限公司；PTQZ-6D型自动涡旋振荡器：常州普天仪器制造有限公司；A10型Milli-Q超纯水机：美国Milli-Pore公司；TGL-16G型高速台式离心机：常州诺机仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：岛津C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：50%甲醇—水等度洗脱；进样量：50 μL；流速：1 mL/min；柱温：40 ℃；检测器：紫外检测器、波长218 nm。

1.3.2 试样制备方法

试样制备：样品采用分样器多次混匀缩分至1 kg，经研磨机粉碎，过40目筛混匀备用。

1.3.3 样品前处理方法优化

称样量优化：分别称取呕吐毒素阳性质控样品25 g、5 g，聚乙二醇5 g、1 g于250 mL具塞三角瓶和50 mL离心管中，分别加入超纯水100 mL、20 mL混匀，置于全自动涡旋震荡器中震荡20 min，10 000 r/min离心5 min，留上清液备用，即为样品提取液。取2 mL的提取液过呕吐毒素免疫亲和柱，10 mL水淋洗，吹干免疫亲和柱，准确移取1 mL甲醇洗脱免疫亲和柱至试管中，于50 ℃水浴加热条件下氮吹至近干加入1 mL初始流动相复溶，0.45 μm滤膜过滤，收集滤液于样品瓶中，以备进样。

提取剂用量优化：称取5 g样品，用10、20、25、30 mL超纯水进行提取。其余均按上述制备方法操作，分析结果的影响。

净化条件优化：取1 mL甲醇洗脱免疫亲和柱至试管中，于50 ℃水浴加热条件下氮吹至近干加入1 mL初始流动相复溶与1 mL甲醇洗脱免疫亲和柱至试管中，不经过氮吹直接加入1 mL超纯水混匀，分析结果的影响。

1.3.4 标准工作曲线配制

标准储备液配制：准确移取100 mg/L的呕吐毒素标准物质1 000 μL于10 mL容量瓶中，使用初始流动相定容至刻度，配制成10 μg/mL的标准储备液。

标准工作液配制：准确移取适量的呕吐毒素标准储备液用初始流动相稀释，配制成100、200、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL的标准系列工作液，4 ℃保存，有效期7 d。

1.3.5 方法验证

根据GB/T 5009.1—2003《食品卫生检验方法 理化部分 总则》[13]附录A及GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》[14]附录F的规定，对该方法的线性关系、灵敏度、检出限、定量限、重复性、准确性等进行验证。

2 结果与分析

2.1 称样量优化

实验对比了称取呕吐毒素阳性质控样品25 g、聚乙二醇5 g、超纯水100 mL提取与称取呕吐毒素阳性质控样品5 g、聚乙二醇1 g、超纯水20 mL提取对结果的影响，结果见表1。结果显示，缩小称样量至5 g对检测结果影响不大，接近阳性质控样品的标准值。但是当称样量为5 g时可以采用50 mL一次性离心管置于多孔位全自动涡旋振荡器来进行提取，能够一次性提取更多样品，并且能节约样品和试剂，同时使用一次性离心管代替锥形瓶可减少样品交叉污染的风险。

2.2 提取剂用量优化

实验对比了称取5 g样品时，用10、20、25、30 mL超纯水进行提取对结果的影响，结果见表2。结果显示，10 mL超纯水提取效果不佳，其余3种用量对结果影响不大，均在阳性质控样品标准值误差允许范围内，但25 mL超纯水的提取效果最好，最接近标准值。

2.3 氮吹对检测结果的影响

实验对比了1 mL甲醇洗脱免疫亲和柱至试管中，于50 ℃水浴加热条件下氮吹至近干加入1 mL初始流动相复溶与1 mL甲醇洗脱免疫亲和柱至试管中，不经过氮吹直接加入1 mL超纯水混匀对结果的影响，结果见表3。结果显示，减少氮吹环节较氮吹后的结果差异不明显，且其结果均在阳性质控样品标准值误差允许范围内。同时不氮吹的样品峰附近无大的杂峰干扰，见图1。不进行氮吹不仅可避免氮吹过程对待测成分的影响，同时又可以较大程度节约前处理的时间。

2.4 方法的线性关系、灵敏度、检出限、定量限、重复性、准确性

2.4.1 方法的线性关系

将浓度分别为100、200、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL的标准系列工作液，按照1.3.1的色谱条件进样测定，以呕吐毒素标准工作浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线见图2，线性回归方程为Y=0.084 8X-2.192 8，相关系数R2=0.999 97，结果表明呕吐毒素浓度在100～5 000 ng/mL范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.4.2 方法的灵敏度、检出限、定量限测定

根据GB/T 5009.1—2003附录A的规定，线性回归曲线的斜率b是方法的灵敏度，故该方法的灵敏度为0.084 8。以3倍信噪比（S/N=3）确定检出限为18.4 μg/kg，以10倍信噪比（S/N=10）确定定量限为61.3 μg/kg。满足GB 5009.111—2016对检出限和定量限的要求。

2.4.3 方法的重复性和准确性

以阴性玉米样品为基质，添加一定量呕吐毒素标准溶液，使其添加水平为玉米呕吐毒素限量标准的0.5倍（500 μg/kg）、1倍（1 000 μg/kg）、2倍（2 000 μg/kg）。分别做6个平行样品按照1.3.1的色谱条件进样测定，呕吐毒素回收率及重复性结果见表4。结果表明，本方法呕吐毒素回收率为90.04%～108.42%，方法和仪器重复性测定的相对标准偏差（RSD）为3.69%～6.70%。满足GB/T 27404—2008对重复性和准确性的要求。

3 结 论

本文优化了玉米中呕吐毒素的测定，建立了一种快速、准确地大批量检验玉米中呕吐毒素含量的测定方法。研究发现，适当的减少称样量xP2DBxGFdQDmvnZs16mOpkvFI3HUphm6xuDTXKq8QXI=、增大提取液比例能够使提取效果更好；样品前处理过程不使用PBS缓冲溶液对测定结果几乎无影响，使用一次性离心管代替锥形瓶可减少样品交叉污染的风险，不需要氮吹既可避免氮吹过程对待测成分的影响又可以较大程度节约前处理的时间。实验结果表明，该方法从提取到净化色谱分离的时间控制在40 min内完成。方法检出限为18.4μg/mL，定量限为61.3 μg/mL，样品回收率在90.04%～108.42%，相对标准偏差（RSD）为3.69%～6.70%，显示出较高的精密度和回收率。说明该方法实用性强、稳定性高、效率显著提升，可适用于大规模玉米样品监测。

参 考 文 献

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