粮食中玉米赤霉烯酮含量测定的前处理方法优化

摘要：优化GB 5009.209—2016高效液相色谱法前处理过程，建立新的粮食中玉米赤霉烯酮含量的高效液相色谱测定方法。样品经乙腈-水（V乙腈：V水=4∶1）调速振荡器提取，免疫亲和柱富集净化，甲醇洗脱后，直接用水稀释定量至2.00 mL，采用 C18反相色谱柱 （150 mm×4.6 mm，5.0 μm），在10～500 ng/mL的质量浓度范围内线性关系良好，其相关系数R2为0.999，检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为3.8 μg/kg、12.8 μg/kg，3个浓度水平加标回收率为94.3%～106.3%，精密度为0.8%～6.1%，连续4天的基质加标回收率为96.7%～104.8%，日间精密度为0.8%～4.3%，高效液相色谱可以很好地对粮食中玉米赤霉烯酮进行快速准确定量分析。经验证该方法与国标方法检测结果无显著性差异。与国标相比，尤其是本方法通过去除氮吹、省去流动相复溶步骤可实现快速、简便、批量检测，提高了工作效率。

关键词：粮食；玉米赤霉烯酮；高效液相色谱；免疫亲和柱；前处理

中图分类号：TS212.7 文献标志码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20240224

Optimization of pre-treatment method for determining the content of zearalenone in food

Tang Linghui， Yang Zhengfei

（ Yongzhou Food Quality and Safety Supervision， Inspection and Testing Center， Yongzhou， Hunan 425000 ）

Abstract： Optimization of the pretreatment process of high-performance liquid chromatography in GB 5009.209—2016， and the establishment of a new high-performance liquid chromatography method for the determination of Zearalenone in grain. The samples were extracted by（Vacetonitrile：Vwater=4∶1 ）speed-regulating oscillator， enriched and purified by an immunoaffinity column， and eluted with methanol. The eluate was then diluted and quantified to 2.00 mL with water directly， analyzed using a C18 reversed-phase chromatographic column （150 mm×4.6 mm， 5.0μm）. The linear relationship was good within the mass concentration range of 10-500 ng/mL， with a correlation coefficient （R2） of 0.999. The detection limit （LOD） was 3.8 μg/kg， and the quantitative limit （LOQ） was 12.8 μg/kg， the recoveries were 94.3%～106.3%， the precision was 0.8%～6.1% ， the recoveries were 96.7%～104.8%， the daytime precision was 0.8%～4.3%. The high-performance liquid chromatography can be used for rapid and accurate quantitative analysis of Zearalenone in grains. Compared with the national standard method， there was no significant difference. Especially， the method can realize rapid， simple， and batch detection by removing nitrogen blowing and removing the steps of mobile phase re-dissolving， thus improving the working efficiency.

Key words： grains； zearalenone； high-performance liquid chromatography； immunoaffinity； pretreatments

玉米赤霉烯酮主要由镰刀菌属株产生，其成分为粉红镰刀菌、禾谷镰刀菌等产生的2，4-二羟基苯甲酸内酯类化合物[1]。玉米赤霉烯酮主要污染玉米、麦类、高粱等农作物，具有很强的雌性激素作用，可引起严重的生殖道症及不孕症，还具有免疫毒性和遗传毒性，有潜在的致癌风险，是仓储粮食中常见的一种真菌毒素污染物[2-3]。

目前，测定粮食中玉米赤霉烯酮含量的主要方法为液相色谱法、高效液相色谱液质联用法等[4-9]。本研究结合自身多年从事真菌毒素的检测与研究，提出对国家标准GB 5009.209-2016《食品安全国家标准 食品中玉米赤霉烯酮的测定》[10]中第一法液相色谱法的前处理过程进行优化改进的建议，通过增加对试样采样量和制备的要求、降低料液比和提取液乙腈浓度、采用调速振荡浸提设备、去除氮吹、省去流动相复溶等方面进行优化，探索出一条既与国标方法检测结果无显著性差异，又能快速简便、灵敏度高、操作安全、可实现批量检测的方法。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

1260型高效液相色谱仪：安捷伦科技（中国）有限公司；HY-4A型调速振荡器：常州澳华仪器有限公司；玉米赤霉烯酮免疫亲和柱：（柱容量为2 000 ng），北京华安麦科生物技术有限公司；甲醇中玉米赤霉烯酮溶液标准物质：20.52±0.25 μg/mL，国家粮食和物资储备局科学研究院；玉米粉中玉米赤霉烯酮分析质控样品：92±19 μg/kg，北京美正检测技术有限公司；甲醇（色谱纯）：德国默克公司；乙腈（色谱纯）：德国默克公司。

1.2 试样制备

采样量需大于1 kg，玉米、小麦等谷物及其制品直接粉碎，过筛，并过2 mm实验筛，混合均匀，放置备用。

1.3 优化的试样提取

称取20±0.01g试样置于250 mL锥形瓶中，加入100 mL提取液（V乙腈：V水=4∶1）混匀，调速振荡器（200～300 r/min）剧烈振荡20 min，静止后，过滤并收集滤液。

采用移液管准确移取10.0 mL滤液置于100 mL锥形瓶中，加入40.0 mL去离子水稀释，再用微纤维滤纸过滤并收集滤液，作为免疫亲和柱净化上样液备用。

1.4 优化的亲和柱净化

取出免疫亲和柱，放置室温平衡后，免疫亲和柱上端与一次性注射器（25 mL）固定，下端去掉塞子后，待保护液流尽前，准确移取25.0 mL上样液，保持重力作用自然流下；待液体排干后，用10 mL去离子水洗涤2次；用洗耳球排尽免疫亲和柱内液体，准确移取1.00 mL甲醇（色谱纯）洗脱玉米赤霉烯酮，并用去离子水稀释定量至2.00 mL，混匀后用0.22 μm微孔滤器过滤，置于样品瓶待测。

1.5 优化的玉米赤霉烯酮标准溶液配制

取质量浓度为20.52±0.25 μg/mL玉米赤霉烯酮标准溶液，加入甲醇—水溶液（V甲醇∶V水= 2∶1）稀释，将其依次配制成质量浓度为10、20、30、60、100、200、500 ng/mL的玉米赤霉烯酮标准工作液。

1.6 色谱条件

色谱柱分析柱：C18 柱，5.0 μm，150 mm×4.6 mm；流动相：水—甲醇—乙腈溶液（V水∶V甲醇∶V乙腈= 23∶4∶23）；进样量：100 μL；荧光检测波长：激发波长274 nm，发射波长440 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法的优化

与GB 5009.209-2016《食品安全国家标准 食品中玉米赤霉烯酮的测定》检测方法相比，本方法增加了对试样采样量和制备的要求，需大于1kg，且全粉碎后使其至少通过粒径小于2 mm孔径实验筛。因为通过多年的粮油检测工作证实，真菌毒素准确分析中的决定性因素、最大的误差来源是样品的扦样与制备，这也与相关文献报告一致[11]。其次，本方法检测样品由40 g降低为20 g，且提取液中乙腈体积分数由90%优化为80%，降低了料液比和提取液乙腈浓度，不仅可以增加提取效果，而且可以减小较大比例的乙腈对亲和柱上抗体的破坏。再者，将浸提设备均质器更换为调速振荡器，调速振荡器价格便宜且便于操作，延长提取时间至20 min，保证玉米赤霉烯酮的充分提取。最后，在国标中采用流动相水—甲醇—乙腈溶液（V水∶V甲醇∶V乙腈=23∶4∶23）稀释配制玉米赤霉烯酮标准工作液，并且为了使前处理后的样品溶剂浓度与标准工作液保持一致，洗脱下的样液经55℃以下氮吹，再用流动相复溶，而本优化的方法是采用甲醇—水溶液（V甲醇∶V水=2∶1）稀释配制玉米赤霉烯酮标准工作液，在加入甲醇洗脱后，采用水直接稀释定量至2.00 mL，去除氮吹步骤，既减小了损失的可能性，又节省了时间，提高了工作效率。其2种方式下稀释配制的各浓度梯度保留时间和峰面积见下表1，并以60 ng/mL质量浓度2种方式下的色谱图为例，见图1。结果发现采用甲醇—水溶液（V甲醇∶V水=2∶1）直接定容，其色谱峰面积稍大，从而检测灵敏性更高。可见，去除氮吹、省去流动相复溶步骤完全满足对粮食中玉米赤霉烯酮含量的测定。

2.2 线性关系、检出限和定量限

采用确定的液相色谱条件，对配制所得的玉米赤霉烯酮标准工作液（10～500 ng/mL）依次进行分析。在10～500 ng/mL的浓度范围内呈现良好线性关系，其线性方程为If = 0.018 4×c+0.005 5，相关系数R2为0.999。通过液相色谱软件计算，以基线噪声3倍峰面积确定方法的检出限，以基线噪声10倍峰面积确定方法的定量限，得玉米赤霉烯酮的检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为3.8 μg/kg、12.8 μg/kg，本方法检出限和定量限均低于国家标准，能完全满足粮食中玉米赤霉烯酮的测定需求。

2.3 方法的回收率与精密度

选取不含玉米赤霉烯酮的空白玉米样品称取20.00g，分别添加玉米赤霉烯酮标准溶液致使试样含有20、60、180 μg/kg（添加量当量）等3个浓度水平，混匀，放置60 min以上，使其达到平衡，再采用本文中优化的前处理方法进行回收率与精密度测定，每个添加水平作3次平行，其结果见表2。从回收率与精密度数据可以看出，本方法测定玉米赤霉烯酮的回收率全部在94.3%～106.3%，3个浓度水平分别添加3次重复测定的精密度为0.8%～6.1%，基本满足粮食中玉米赤霉烯酮定量检测对回收率与精密度的要求。

2.4 日间精密度

选取不含玉米赤霉烯酮的空白玉米样品称取20.00g，添加玉米赤霉烯酮标准溶液致使试样含60 μg/kg（添加量当量），作3平行，再采用本文中优化的前处理方法进行连续4天日间精密度测定，其结果见表3。结果显示连续4天的加标回收率范围为96.7%～104.8%，其日间精密度为0.8%～4.3%。可见，本方法对粮食中玉米赤霉烯酮的测定具有良好的重现性。

2.5 实际样品测试及方法比对

分别对6份玉米样（样品编号为：1～6号）、3份小麦样（样品编号为：7～9号）、3份玉米粉样（样品编号为：10～12号），其中第12号为玉米粉中玉米赤霉烯酮分析质控样：（92±19） μg/kg和1份面条样（样品编号为：13号）应用本实验改进的前处理方法和国标法进行比对检测，计算2种前处理方法测定结果的精密度，并采用t检验，评价其测定结果是否一致，结果见表4。2种前处理方法测定结果的精密度均满足国标要求（精密度<15%）；经t检验分析，2种前处理方法测定结果无显著性差异（P>0.05），因此，本方法可用于大批量粮食中玉米赤霉烯酮含量的检测。

3 结 论

本研究通过增加试样采样量和制备的要求、降低料液比和提取液乙腈浓度、采用调速振荡器浸提设备、去除氮吹、省去流动相复溶等玉米赤霉烯酮测定前处理方法的优化，测得的玉米赤霉烯酮含量与国标方法无显著性差异；采用本方法测定玉米赤霉烯酮含量，其保留时间稳定且峰形良好，可以很好地对粮食中玉米赤霉烯酮进行快速定量分析，在10～500 ng/mL范围内呈现线性关系良好，其相关系数为0.999，检出限和定量限分别为3.8 μg/kg、 12.8 μg/kg，3个浓度水平加标回收率为94.3%～106.3%，精密度为0.8%～6.1%，连续4天的基质加标回收率为96.7%～104.8%，日间精密度为0.8%～4.3%。尤其是本方法通过去除氮吹、省去流动相复溶步骤可实现快速简便检测，提高了工作效率，降低实验人员与玉米赤霉烯酮、有机试剂等有害物质长时间接触的风险，并为基层实验室大批量快速准确测定粮食中玉米赤霉烯酮提供了方法[12]。

参 考 文 献

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