橡胶树白粉菌保守效应蛋白致病机制研究

关键词：橡胶树；白粉菌；效应蛋白

中图分类号：S432.1 文献标志码：A

病原菌与植物的互作过程中，要突破植物的免疫系统，才能够实现成功侵染。在这个过程中，病原相关分子模式（pathogen-associated molecularpattern）往往被植物细胞表面的模式识别受体（pattern recognition receptor）识别，激发保守分子模式触发的免疫（PAMP-triggered immunity）[1]。然而， 很多病原菌可分泌效应蛋白（ effectorproteins）抑制植物的免疫，效应蛋白是病原菌致病的关键毒性因子，大部分植物真菌或卵菌的效应蛋白在分泌后可作用于侵入点的植物细胞，影响植物细胞对病原的识别，抑制胞内免疫信号途径，效应蛋白的核心功能是抑制植物免疫，促进自身侵染[2]。

白粉菌是一种活体营养型专性寄生真菌，在与宿主互作的过程中，会穿透宿主细胞壁形成吸器在宿主细胞内获得水分和营养，同时产生大量的效应蛋白分泌至宿主细胞内，从而促进真菌的增殖和侵染[3]。目前已针对大小麦白粉菌和侵染豆科作物、葫芦科作物、葡萄、拟南芥等的白粉菌开展了寄主-病原互作机理研究。目前已预测到白粉菌特有的一类候选效应蛋白可能是侵染寄主过程中的重要武器。预测到的效应蛋白（candiatesecreted effector proteins， CSEPs）需符合以下3 个特征：（1）编码蛋白N 端存在预测信号肽（signalpeptide）序列；（2）信号肽剪切位点后无跨膜域结构；（3）白粉菌外的物种中无同源序列[4]。解析CSEPs 的功能将深入了解病原菌致病机理，并促进病害防控。但很多CSEPs 的功能仍是未知的。

对于一些专性寄生真菌，常利用寄主诱导的基因沉默（host-induced gene silencing， HIGS）来研究效应蛋白功能。HIGS 需要构建表达沉默RNA 的转基因植物，而有些寄主植物难以实现转基因，因此限制了HIGS 的应用范围。喷施诱导基因沉默（spraying-induced gene silencing， SIGS）技术通过喷施外源RNA 传递到植物、病原菌等生物体表面，进而沉默生物体关键基因[5]，SIGS 具有与HIGS 类似的功能，但不依赖于作物基因转化，应用范围更广。对于专性寄生真菌，包括橡胶树白粉菌（Erysiphe quercicola）[6]、葡萄白粉菌（E. necator）[7]、葫芦科白粉菌（E. cucurbitacearum） [8] 、大豆锈病病原菌（ Phakopsorapachyrhizi）[9]，已应用SIGS 进行真菌基因沉默，并展示出良好的沉默效果。

橡胶树（Hevea brasiliensis）为多年生木本植物，是天然橡胶的主要来源[10]，但橡胶树白粉菌侵染引起白粉病连年爆发，导致橡胶产量下降[11]。在前期工作中，对橡胶树白粉菌全基因组完成了测序，从中预测到133 个CSEPs[12]，但对这些CSEPs 在侵染中发挥的功能几乎是未知的。本研究对其中一个保守的效应蛋白CSEP02974 开展致病功能研究，该效应蛋白在其他7 个白粉菌中均有同源基因，因此这类蛋白可能是多个白粉菌的致病因子。酵母蔗糖转化酶分泌试验证明了CSEP02974 信号肽具有引导蛋白分泌的活性。烟草定位试验表明CSEP02974 可能在植物中被转运至植物细胞内。在拟南芥中表达该效应蛋白可以抑制植物免疫。由于橡胶树难以实现转基因，无法通过HIGS 进行基因沉默，因此采用适用范围更广的SIGS 进行研究。基因沉默和致病性测试显示，该效应蛋白为白粉菌致病所需。本研究鉴定到一个橡胶树白粉菌致病的关键效应蛋白，为进一步研究橡胶树-白粉菌互作分子机理提供良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供试的本氏烟草（Nicotianabenthamiana） 、橡胶树热研7-33-97、拟南芥（Arabidopsis thaliana）由本实验室提供。在橡胶树叶片古铜期进行致病性试验，在烟草、拟南芥第4～6 周时开展农杆菌介导的瞬时表达试验。

1.1.2 质粒及菌株 橡胶树白粉菌HO-73 菌株接种于橡胶树叶培养，由本实验室保存、提供；酵母YTK12 菌株感受态由本实验室保存提供；pBin-GFP 载体为本实验室构建保存；大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）GV3101 购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.3 试剂 植物总RNA 提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，逆转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit 和限制性内切酶购自Thermo Fisher Scientific，高保真DNA 聚合酶试剂盒Prime STAR HS DNA Polymerase（Cat.R040A）购自TaKaRa 公司，通用型DNA纯化回收试剂盒（Cat.DP204）购自天根生化科技（北京）有限公司，质粒提取试剂盒（Cat.C201-01）、同源重组试剂盒ClonExpress Ⅱ One StepCloning Kit（Cat.C112-01）购自诺维赞（南京）生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆及载体构建 利用本实验室发表的橡胶树基因组数据及注释文件查找CSEP02974基因的完整序列，通过Premier 5.0 软件设计基因扩增引物CSEP02974-F/R（表1）。PCR 反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，32 个循环，72 ℃再延伸10 min，4 ℃待机。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，将含有目的基因的条带用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化。将回收产物与pBin-GFP 载体连接，转化DH5α 感受态细胞后进行Sanger测序。使用限制性内切酶BamHⅠ对pBin-GFP 载体进行酶切，设计引物pBin-CSEP02974-F/R、pBin-CSEP-02974ΔSP-F/R、SPPR1-CSEP02974-GFP-F（表1），扩增CSEP02974 基因，通过同源重组构建pBin-CSEP02974-GFP、pBin-CSEP02974^ΔSP-GFP、SPPR1-CSEP02974-GFP 载体。利用Lti6b-F/R 引物从拟南芥cDNA 中扩增Lti6b（At3g05890），并克隆至35S-RFP 表达载体上，完成Lti6b-mRFP 表达载体的构建。所有载体均通过PCR 检测和生工生物工程（上海）股份有限公司测序验证其准确性。

1.2.2 农杆菌介导的本氏烟草和拟南芥转化 将构建的植物表达载体转入农杆菌GV3101 的感受态中。在含有50 μg/mL 卡那霉素（kanamycin）和25 μg/mL 利福平（rifampicnic）的LB 培养基中28 ℃振荡培养2～3 d 后离心（5000 r/min，5 min）菌液3 次，用氯化镁缓冲液（10 mmol/LMES， 10 mmol/L MgCl2， 100 μmol/L AS）[13]悬浮，并将OD 调至0.6，室温静置2 h 后用注射器将菌液接种至生长4～6周的本氏烟叶背面。参考蘸花法[14]在LB 培养基中培养含有CSEP02974-GFP质粒的土壤杆菌，于28 ℃恒温摇床5000 r/min 培养48 h。然后以相同转速离心10 min，收集菌体。参考蘸花法[14]配置转化悬浮液，确保土壤杆菌悬浮液的OD 大于0.6。从培养4 周龄的野生型Col-0 拟南芥中选择正常生长和发育的植株，将修剪的拟南芥植株花苞浸泡在土壤杆菌悬浮液中，5 min 后密封，暗箱处理24 h。培养转化后的拟南芥植株至8 周龄，于37 ℃烘箱烘48 h。加热溶解1/2MS 固体培养基，每100 mL 中加入50 μL 潮霉素溶液，倒入平板中。拟南芥种子处理：75%乙醇浸泡15 s，去离子水漂洗，2%次氯酸钠溶液中浸泡2 min，再次漂洗，置于1/2MS 培养基中无菌萌发。筛选经萌发的拟南芥幼苗，按营养土与蛭石比例3∶1 移栽，植株成熟后提取DNA 验证转化子，选择T2 代转基因植株进行后续试验。

1.2.3 鲁米诺法（Luminol）测定拟南芥叶片活性氧（ROS）的变化 在96 孔板中加入90 μL ddH2O和10 μL 鲁米诺过氧化物酶缓冲液（200 μmol/Lluminol， 10 μg/mL 过氧化物酶）。向96 孔板中加入拟南芥叶盘（约10000 个），并加入10 μmol/L（GlcNAc）7。用酶标仪检测荧光强度的变化情况（发射波长为530nm，激发波长为400 nm），以荧光强度表示ROS 迸发水平1.2.4 拟南芥叶片胼胝质积累测定 本氏烟草叶片成功注射农杆菌2 d 后，摘取叶片放于脱色液（乙醇∶乙酸=3∶1）中脱色至透明，透明叶片用0.01% 苯胺蓝溶液（ 苯胺蓝溶于0.067 mol/LKHPO 溶液）进行避光染色4 h，荧光显微镜（发射波长为665 nm，激发波长为600 nm）下观察胼胝质积累情况，使用ImageJ 软件计算每100 mm²胼胝质的积累数量。

1.2.5 酵母表达载体构建 酵母表达载体pSUC2、pSUC2-Avr1b 由本实验室保存。将pSUC2 载体用EcoRⅠ和XhoⅠ限制性内切酶酶切，用Cycle PureKit 纯化试剂盒纯化回收。用CSEP02974SP-F/R 引物KeyPo Master Mix 聚合酶扩增CSEP02974 的信号肽全长，用Gel Extraction Kit 纯化试剂盒纯化回收。用ClonExpress One Step Cloning Kit 将纯化后的SP 片段克隆到pSUC2 载体中得到pSUC2-CSEP02974-SP 酵母分泌载体。操作方法和反应体系均参考产品使用说明书，所有载体均通过PCR检测和生工生物工程（上海）股份有限公司测序验证其准确性。

1.2.6 酵母分泌试验 用酵母分泌系统对CSEP02974 的信号肽功能进行验证。将pSUC2、pSUC2-Avr1b、pSUC2-CSEP02974SP 载体用经典酵母转化试剂盒进行转化得到含有相应载体的酵母菌株，操作步骤参考产品使用说明书。将含有不同载体的酵母菌株分别接种于CMD-W 和YPRAA 培养基平板上，验证YTK12 是否含有转化酶的活性。转化酶可将氯化三苯四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride， TTC）还原为1，3，5-三苯甲臜（1，3，5-triphenylformazan， TPF）形成不溶红色沉淀，以进一步验证信号肽的功能。

1.2.7 蛋白提取和免疫印迹分析 剪下本氏烟草叶片蛋白表达区域，加入液氮研磨叶片成粉状。在1.5 mL 离心管中加入1 mL 植物蛋白裂解液和5 μL 蛋白酶抑制剂以及研磨的植物叶片，放于冰上冰浴30 min，每5 min 震荡1 次，4 ℃下，12000 r/min 离心10 min，取上清液至新的离心管中。用移液枪吹打悬浮Anti-GFP 免疫磁珠，转移30 μL 混合液到新的离心管中。加入500 μL 1×PBST，移液枪吹打悬浮Anti-GFP 磁珠，800 r/min离心1 min，弃上清液，向沉淀中加入提取的植物蛋白500 μL，4 ℃下，50 r/min 孵育6 h。4 ℃800 r/min 离心3 min，将上清液转移至新的离心管中备用。加入500 μL 1×PBST 上下翻转样品1 min，4 ℃，800 r/min 离心3 min，磁性分离后弃上清液。重复洗涤3 次，直至洗涤后的上清液OD 小于0.05，弃上清液。向所得沉淀中加入100 μL 1×PBST 吸打，加入30 μL 蛋白上样缓冲液，加热煮沸15 min，冷却至室温后用GFP 一抗缓冲液、荧光二抗进行Western Blot 检测。根据Western Blot 图像中条带大小判断蛋白是否表达。

1.2.8 CSEP02974-dsRNA 的体外合成及处理选择CSEP02974 序列中特异性最高的区域为dsRNA 体外转录模板序列，根据Invitro TranscriptionT7 Kit（TaKaRa）使用说明合成并纯化dsRNA。利用浓度为2×10⁵ 个/mL 的白粉菌孢子悬浮液接种古铜期橡胶树叶片， 24 h 后喷施0.1 μg/mL dsRNA 至叶片接菌处。在接种后第7天对橡胶树叶片病斑进行致病性分析。

1.2.9 CSEP02974 表达的qRT-PCR 分析 分别收集橡胶树叶片上经过沉默处理后第7 天的叶片于液氮中研磨至粉末，用Eastep R Super totalRNA Extraction Kit 总RNA 提取试剂盒（PromegaBiotech）提取所有样品的总RNA。用RevertAidFirst Stand cDNA Synthesis Kit 反转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific）将总RNA 反转录为cDNA。橡胶树的Actin 基因作为内参，使用Quant-StudioTM5 RealTime PCR 仪器（Thermo FisherScientific）和SuperReal PreMix Plus 荧光定量试剂盒（TianGen Biotech）进行qRT-PCR 检测，利用QuantStudioTM Design & Analysis Softwarev1.5.2软件对基因表达量进行分析。操作方法参考使用说明书。

2 结果与分析

2.1 CSEP02974抑制植物免疫防卫反应功能分析

本研究选取橡胶树白粉菌效应蛋白CSEP-02974 进行试验，经过NCBI（national center forbiotechnology information， http：//ncbi.nlm.nih.gov/）比对，发现该蛋白与其他白粉菌种的蛋白均具有较高的氨基酸相似性（表2），表明CSEP02974 可能是保守的致病因子。

为了研究CSEP02974 是否具有保守的抑制植物免疫的功能，构建了携带CSEP02974 的表达载体pBin-CSEP02974-GFP。通过农杆菌转化法，对拟南芥Col-0 进行转化，获得表达CSEP02974-GFP 的转基因株系，并且通过逆转录PCR 分析验证拟南芥中CSEP02974-GFP 的表达（图1A）。真菌来源的几丁质（chitin）和细菌来源的flg22 是已报道的PAMP[15]，分别用10 μmol/L 几丁质单体（GlcNAc）7 和10 μmol/L flg22 处理拟南芥叶片36 h，利用苯胺蓝（aniline blue）染料对胼胝质染色，并统计胼胝质形成量。统计结果显示，flg22和（GlcNAc）7 均可以激发野生型（WT）拟南芥叶片形成大量的胼胝质，而表达CSEP02974 的拟南芥叶片中，胼胝质数量明显减少（图1B，图1C）。

通过鲁米诺化学发光的方法检测CSEP02974-GFP（浓度为5 μmol/L）处理后拟南芥叶片活性氧（ROS）的含量变化。结果显示，（GlcNAc）7和flg22 诱导叶肉原生质体ROS 的积累，在50 min时ROS 积累量较高，而表达CSEP02974 的叶盘中ROS 含量较少（图1D）。

2.2 CSEP02974的分泌功能验证

为了测试CSEP02974 是否为分泌蛋白，通过SignalP-5.0 在线系统（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）对CSEP02974 的蛋白序列进行分析，预测到CSEP02974 的第1～22位氨基酸为信号肽序列。为了确认CSEP02974 的假定N 端信号肽的分泌功能，通过蔗糖酶缺陷型酿酒酵母YTK12 菌株测试信号肽活性[16]。将CSEP-02974 信号肽序列连接至含有蔗糖酶（invertase）基因的pSUC2 载体上，之后把构建的载体转入YTK12 酵母菌株中，28 ℃培养3 d 后，转化含CSEP02974 信号肽的YTK12 菌株在含棉子糖的YPRAA 培养基上生长较快。另外，在化学催化方法中，转化含CSEP02974 信号肽的YTK12 菌株能使透明状态的TTC溶液转化为不可溶的红色物质TPF（图2）。以上结果表明CSEP02974 信号肽具有活性，因此CSEP02974 可能为分泌蛋白。

2.3 CSEP02974 的定位分析

为了研究CSEP02974 在分泌后是否转运至植物细胞内，本研究利用本氏烟草瞬时表达所测试的蛋白并研究其定位（图3A）。使用30%蔗糖溶液诱导烟草细胞质壁分离， 并以共表达的Lti6b-mRFP 作为细胞膜标签[17]。以单独的GFP作为对照，当将烟草PR1 蛋白信号肽（SP）连接至GFP，观察到SP-GFP 蛋白在植物胞质中信号减弱（图3B），说明PR1 蛋白信号肽可以引导GFP 蛋白分泌出植物细胞。将SP 替换CSEP02974 自身信号肽和使CSEP02974 融合GFP标签，观察到SP-CSEP02974-GFP 在植物胞质中信号较强（图3B），表明SP引导CSEP02974分泌出细胞后，CSEP02974 又可被转运至胞质。同时，观察到含自身信号肽的CSEP02974-GFP或删除信号肽的CSEP02974-GFP（CSEP02974^ΔSP_GFP）和单独GFP类似，均主要定位在胞质中（图3B）。上述结果表明CSEP02974 可被植物转运至细胞质。

2.4 CSEP02974的致病性分析

为研究CSEP02974 在白粉菌侵染过程中的作用，接种白粉菌24 h 后，将合成的CSEP02974-dsRNA 稀释至0.1 μg/mL 后喷施于已接种白粉菌的橡胶树叶片表面，并于接种7 d 后观察白粉菌侵染情况（图4A）。与野生型（WT）和喷洒GFP序列的dsRNA（GFP-dsRNA） 相比， 喷施CSEP02974-dsRNA 的植株上白粉菌引起的症状明显减轻，病斑面积仅为GFP-dsRNA 处理的11.11%（图4B）。对经dsRNA 处理过的橡胶树叶片进行取样，以白粉菌EF1a 引物为内参，采用qRT-PCR 检测CSEP02974 在侵染过程中的表达情况（图4C）。结果表明，CSEP02974-dsRNA 处理后，CSEP02974 的表达水平为野生型的39%，为GFP-dsRNA 处理的48%。以上结果表明，叶面喷施CSEP02974-dsRNA 可导致侵染橡胶树的白粉菌基因沉默，并显著抑制白粉菌的侵染和在叶片内的扩展。

3讨论

橡胶树为多年生木本植物，因其自然特性，其抗病基因鉴定和育种较难开展，抗病资源稀缺；并且对于专性寄生真菌，特别是白粉菌，目前对这类真菌的效应蛋白的基因功能缺乏了解，因此，亟需进行寄主-病原互作机制的研究，以探寻抑菌的新靶点。

活性氧迸发和胼胝质的积累被认为是植物应对病原物侵染的基础防卫反应[18]，利用农杆菌介导的瞬时表达方法，观察候选效应蛋白是否能诱导或抑制模式植物细胞活性氧爆发、胼胝质沉积等反应，是真菌效应蛋白筛选的常用方法[19-20]。如稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）效应蛋白Slp1、小麦禾生球腔菌（Mycosphaerella graminicola）效应蛋白Mg3LysM 可抑制几丁质触发的免疫[21-22]；水稻黄单胞菌T3SS 效应蛋白可抑制flg22诱导的拟南芥的PTI[23]；玉米黑粉菌分泌的Pep1 通过抑制植物的过氧化物酶活性，清除活性氧的积累来保护菌丝[24]。为了检测克隆的候选效应蛋白是否具有免疫抑制的功能，本研究构建了表达CSEP02974-GFP 的转基因拟南芥，用PAMP 进行处理后发现CSEP02974 可抑制flg22 和几丁质诱导的胼胝质和活性氧的积累，确定CSEP02974 为毒性蛋白。

目前对白粉菌效应蛋白的功能验证常用的方法是基因沉默。SIGS 作为一种新型基因沉默技术，其以病原菌生长发育和致病相关基因为靶标，将体外合成的针对靶基因的dsRNA 喷施于植物表面，抑制靶基因的表达[25]。SIGS 已被应用于多种植物病害机理研究，并展示出良好的应用前景。已有报道指出，SIGS 技术能够有效沉默核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、葡萄孢菌（Botrytiscinerea）、禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）等农业上重要的病原真菌[26]。局部应用靶向DCL1 和DCL2 的dsRNA 可抑制水果、蔬菜和花卉的灰霉菌病[23]。SIGS 在白粉菌中的应用也较为广泛，如葫芦科白粉菌CNAP8878、CNAP9066等6 个保守非注释蛋白通过dsRNA 诱导的基因沉默后，出现明显的沉默表型，白粉菌生物量和病状大幅减少[8]。通过SIGS 技术沉默橡胶树白粉菌β-微管蛋白（Tub）、甾醇14α-去甲基化酶（CYP51）和几丁质合酶（Chs）基因，导致致病力下降，病斑大幅减少[6]。这为白粉菌的基因沉默技术提供了新方向。在白粉菌中对CSEP02974 进行基因沉默，通过荧光定量PCR 分析和表型观察发现，沉默该基因会导致白粉菌扩展侵染受抑制。

近年来，对白粉菌效应蛋白的功能鉴定、靶标筛选等研究已经取得了一定进展，但关于白粉菌效应蛋白转运的研究甚少，在效应蛋白功能机制的研究中，对效应蛋白的分泌和转运机制具有重要的研究价值[27]。本研究通过酵母分泌系统验证了CSEP02974信号肽具有分泌活性，通过烟草系统探明了CSEP02974被分泌后进入宿主细胞。目前，效应蛋白在稻瘟菌中的转运机制研究已经取得了一定进展，稻瘟菌效应蛋白从病原菌的侵染菌丝中分泌后，细胞质效应蛋白PWL2 会进入受体植物的细胞质中直接作用于宿主，并能通过转运进入诸多还未侵染菌丝的相邻宿主细胞中，质外体效应蛋白Bas4会停留在由EIHM 膜（extrainvasive hyphal membrane， EIHM）与侵染菌丝膜形成的质外体隔间里[28-29]。效应蛋白的这一系列作用机制的差异性取决于效应蛋白分泌后定位特点的多样性。本研究通过农杆菌介导的烟草瞬时表达技术在烟草叶片中瞬时表达全长效应蛋白，发现CSEP02974 在细胞质壁分离分泌到细胞外后，在细胞膜上仍可见到荧光，推测CSEP02974被分泌到细胞外后又进入细胞质内，推测CSEP-02974 是细胞质效应蛋白。

综上，本研究利用异源表达系统、农杆菌侵染系统、酵母分泌系统以及相对定量、亚细胞定位、SIGS技术鉴定了橡胶树白粉菌关键致病因子，为致病机理研究提供有利支撑。