橡胶树不同发育时期花药愈伤生长发育对低温的响应

关键词：橡胶树；遗传转化；花药愈伤；低温保存；体细胞胚发生

中图分类号：S794.1 文献标志码：A

天然橡胶是重要的工业原料，更是不可或缺的战略物资，其主要来源于巴西橡胶树（Heveabrasiliensis）。现代遗传工程的发展、基因组编辑手段的精准改良加速了培育转基因橡胶树新品种的脚步，随之而来的对于转基因优质受体初代花药愈伤和初代子叶胚的持续供应成为不可忽视的问题。

橡胶树公开报道的遗传转化体系根据受体分为5 种，原生质体[1]、易碎胚性愈伤组织[2]、花药愈伤组织[3-5]、次生胚[6]，其中原生质体再生效率低[7]，易碎胚性愈伤组织再生植株生长势弱[8]，只有花药愈伤组织和次生胚具有商业应用价值。随着技术的不断进步，橡胶树花药愈伤组织的遗传转化效率在不断提高。然而花药愈伤组织为脱分化愈伤，胚性愈伤与非胚性愈伤混合，不能通过继代增殖，需要不断采集外植体，但花蕾来源严重受季节限制，全年可供采花时期短，不能为相应研究提供长期稳定的受体来源。本文研究了不同发育时期花药愈伤在15 ℃和20 ℃低温保存15 d 后，对其愈伤诱导、体细胞胚发生和子叶胚形成的影响，为今后利用低温保存橡胶树初代花药愈伤组织，延长优质胚性愈伤组织、初代子叶胚供应时间，妥善保存橡胶树种质资源提供理论依据，为以初代花药愈伤或初代体细胞胚为受体的转基因研究供体保障提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为大规模推广级品种橡胶树热研73397 春季幼嫩雄花，采自位于海南省儋州市中国热带农业科学院橡胶研究所试验基地。

1.2 方法

1.2.1 外植体的选择与接种 从健康的橡胶树上采集雄性幼花，将有花序的枝条用湿毛巾敷盖，塑料袋包裹储存，立即带回实验室。用镊子从花序中挑选黄绿色的胸花在75%的乙醇浸泡1 min，期间摇晃数次，无菌水冲洗1 遍，随后用0.1%升汞浸泡10 min，期间晃动数次，无菌水冲洗3～5遍。无菌的超净工作台中，在显微镜下用解剖针剥开花蕾表皮取出完整雄花接种于培养皿中，每皿接种7 个外植体。

1.2.2 橡胶树低温保存花药愈伤及保存后室温诱导愈伤组织/恢复 共设置花药愈伤发育时期、保存温度2 个影响因素。CK 组为一直放置在室温（25±2） ℃暗培养的花药愈伤组织。将经过无菌消毒的橡胶树雄花接种于M1[9]培养基中置于室温培养得到不同发育时期的花药愈伤组织（0、7、14、21、28、35、42 d），然后分别放置于15 ℃及20 ℃培养箱中暗培养15 d，观察低温处理前后花药愈伤的表型，随后放置室温暗培养。跟踪不同处理橡胶树花药愈伤组织发生及恢复情况，每10 d 观察各发育时期的花药愈伤组织发生及恢复情况，30 d 统计愈伤组织诱导率。CK 组室温暗培养35 d 后统计愈伤组织诱导率。愈伤组织诱导率=（花药愈伤组织数/低温培养的花药数）×100%。愈伤组织延长保存时间（d）=实验组花药从外植体接种至可转入至出胚培养基所需总天数-对照组花药从外植体接种至可转入出胚培养基所需总天数。每个处理5 皿，每皿7 个外植体，重复3 次。

1.2.3 橡胶树低温保存花药愈伤组织体细胞胚诱导与成熟 将上述各组花药愈伤组织转至体细胞胚诱导培养基M2[9]中，室温（25±2） ℃暗培养60 d时统计再分化出体细胞胚的花药愈伤组织数（块），继续培养至120 d 时观察并统计胚状体及子叶胚数量（个）。以一直置于室温暗培养的花药愈伤为CK 组。胚性愈伤诱导率=（诱导出体细胞胚的愈伤数/接种愈伤数）×100%；体细胞胚诱导率=（体细胞胚总数/胚性愈伤数）×100%；子叶胚获得率=（子叶胚总数/体细胞胚总数）×100%。体细胞胚延长保存时间（d）=实验组从外植体接种至诱导出子叶胚所需总天数-对照组从外植体接种至诱导出子叶胚所需总天数。

1.3 数据处理

试验数据主要采用Excel 2023和IBM SPSSStatistics 20软件进行整理、统计和分析。

2 结果与分析

2.1 低温保存对不同发育时期橡胶树花药愈伤组织生长的影响

结果表明：（1）不同发育阶段的花药愈伤组织在15 ℃低温下保存15 d，低温保存期间，发育时期为0、7、14、21 d 的花药愈伤无生长迹象，发育时期为28、35、42 d 的花药愈伤有一定生长，但较CK 组均有不同程度延缓（表1）。愈伤外观与CK 组相似，未出现明显冷害（图1B1、B2）；（2）不同发育阶段的花药愈伤组织在20 ℃低温下保存15 d，低温保存期间，发育时期为0、7 d的花药愈伤无生长迹象，发育时期为14、21、28、35 d 的花药愈伤生长情况较CK 组均有不同程度延缓，发育时期为42 d 的花药愈伤生长情况与CK 组相当。愈伤外观与CK 组相似，未出现明显冷害（图1B3、B4）。

2.2 低温保存后不同发育时期橡胶树花药愈伤组织诱导或恢复情况

室温条件下，花药愈伤诱导数为34.33 个，诱导率为98.10%（表1）。

不同发育阶段的花药愈伤组织在15 ℃低温下保存15 d，结果表明，在愈伤诱导阶段，发育时期为28、35、42 d 的花药愈伤诱导情况与CK组的差异不显著。发育时期为7、14 d 的花药愈伤数及诱导率均显著下降（P<0.05），分别较CK组降低5～6 个，15.24%和19.05%。发育时期为0、21 d 的花药愈伤数及诱导率均大幅度下降，分别较CK 组减少16～18 个，45.72%和53.34%（表1）。

不同发育阶段的花药愈伤组织在20 ℃低温下保存15 d，结果表明，在愈伤诱导阶段，发育时期为21、28、35、42 d 的花药愈伤与CK 组无显著差异。发育时期为0、7、14 d 的花药愈伤数及诱导率均显著下降（P<0.05），降幅分别为4～9个和11.43%～25.72%（表1）。

2.3 低温保存后不同发育时期橡胶树花药胚性愈伤诱导情况

室温条件下，胚性愈伤数为25.33 个，诱导率为73.84%（表1，图1D）。

不同发育阶段的花药愈伤组织在15 ℃低温下保存15 d，结果表明，在胚性愈伤诱导阶段，发育时期为28、42 d 的花药愈伤其胚性愈伤数、胚性愈伤诱导率与CK 组无显著差异；其余5 个发育时期与CK 组相比，其胚性愈伤数与胚性愈伤诱导率均显著下降（P<0.05），降幅分别为6～15个和8.09%～33.26%（表1，图1D1、D2）。

不同发育阶段的花药愈伤组织在20 ℃低温下保存15 d，结果表明，在胚性愈伤诱导阶段，发育时期为21、42 d 花药愈伤的胚性愈伤数及胚性愈伤诱导率与CK 组无显著差异；发育时期为28 d 花药愈伤的胚性愈伤数与CK 组无显著差异，胚性愈伤诱导率显著高于CK 组（P<0.05）；发育时期为0、7、14、35 d 的花药愈伤其胚性愈伤数及胚性愈伤诱导率均显著低于CK 组（P<0.05），降幅分别为8～14 个和9.68%～41.90%（表1）。

2.4 低温保存后不同发育时期的花药愈伤组织体细胞胚发生情况

室温条件下，体细胞胚数为87.33个，体细胞胚诱导率为345.15%（表1，图1D）。

不同发育阶段的花药愈伤组织在15 ℃低温下保存15 d，结果表明，在体细胞胚发生阶段，发育时期为14、42 d 的花药愈伤产生的体细胞胚数与CK 组无显著差异，而其他5 个发育时期花药愈伤产生的体细胞胚数较CK 组显著下降，降幅为13～62 个；发育时期为14、21 d 的花药愈伤体细胞胚诱导率较CK 组有显著提高（P<0.05），分别提高了111%和178.49%；发育时期为35 d的花药愈伤的体细胞诱导率显著降低（P<0.05），较CK 组下降159.17%，而其余4 个时期的花药愈伤体细胞胚诱导率与CK 组无显著差异（表1，图1D1、D2）。

不同发育阶段的花药愈伤组织在20 ℃低温下保存15 d，结果表明，在体细胞胚发生阶段，发育时期为21、28、42 d 的花药愈伤体细胞胚数显著高于CK 组（P<0.05），增幅为10～38 个；发育时期为0、7、14、35 d 的花药愈伤体细胞胚数较CK 组显著下降（P<0.05），降幅为20～70 个；发育时期为0、14、42 d 的花药愈伤体细胞胚诱导率比CK 组显著提高（P<0.05），增幅为95.60%～155.53%；发育时期为7、21、28 d 的花药愈伤体细胞胚诱导率与CK 组无显著差异；发育时期为35 d 的花药愈伤的体细胞胚诱导率对比CK 组下降180.76%，差异最为显著（P<0.05）（表1，图1D3、D4）。

2.5 低温保存后不同发育时期花药愈伤组织子叶胚获得情况

对照组的子叶胚数为23.33个，子叶胚获得率为26.58%（表1，图1E）。

不同发育阶段的花药愈伤组织在15 ℃低温下保存15d，结果表明，在子叶胚获得方面，发育时期为21 d 的花药愈伤子叶胚数比CK 组显著提高（P<0.05），较CK 组多约6 个，发育时期为14、28、42 d 的花药愈伤子叶胚数与CK 组无显著差异，发育时期为0、7、35 d 的花药愈伤子叶胚数较CK 组显著下降（P<0.05），降幅为11～19个；发育时期为0、21 d 的花药愈伤子叶胚获得率对比CK 组显著提高（P<0.05），分别较CK 组提高了11.41%和25.29%，而其余5 个发育时期的花药愈伤子叶胚获得率较CK 组无显著差异（表1，图1E1、E2）。

不同发育阶段的花药愈伤组织在20 ℃低温下保存15 d，结果表明，在子叶胚获得方面，发育时期为21、42d的花药愈伤子叶胚数比CK 组显著提高（P<0.05），分别较CK 组增加约7 个和18 个，发育时期为0、7、28d的花药愈伤子叶胚数与CK 组无显著差异，发育时期为14、35d的花药愈伤子叶胚获得数较CK 组显著下降（P<0.05），分别较CK 组减少约13 和20 个；发育时期为21 d 的花药愈伤子叶胚获得率对比CK 组显著性提高（P<0.05），较CK 组提高了15.58%，而其余6个发育时期的花药愈伤子叶胚获得率与CK 组无显著差异（表1，图1E3、E4）。

2.6 低温保存温度与花药愈伤发育时期对低温保存后花药愈伤诱导、分化、发育影响

图2表明，不同低温保存的花药愈伤在各发育阶段生长状况，15 ℃低温保存后的花药愈伤组织在胚性愈伤诱导阶段的胚性愈伤数较CK 组显著下降（P<0.05），其余生长阶段与CK 组无显著差异；20 ℃低温保存后的花药愈伤组织在各生长阶段与CK 组均无显著差异。

图3表明，不同发育时期的花药愈伤低温保存后在各发育阶段生长状况，在愈伤诱导阶段（愈伤诱导数和愈伤诱导率），发育时期为28、35、42 d 的花药愈伤组织与CK 组无显著差异，而其余4 个发育时期的花药愈伤组织较CK 组显著下降；在胚性愈伤诱导阶段（胚性愈伤数和胚性愈伤诱导率），发育时期为28、42 d 的花药愈伤组织与CK 组无显著差异，而其余5 个发育时期的花药愈伤组织较CK 组显著下降（P<0.05），但其中发育时期为21 d 的花药愈伤组织的胚性愈伤数显著下降（P<0.05），胚性愈伤诱导率与CK 组确无显著差异；在体细胞胚诱导阶段，发育时期为14、21、28、42 d 的花药愈伤组织的体细胞胚数与CK 组无显著差异，而其余3 个发育时期的体细胞胚数较CK 组显著下降（P<0.05）、发育时期为14、21 d 的花药愈伤组织的体细胞胚诱导率较CK 组显著提高（P<0.05），发育时期为0、7、28、42 d 的花药愈伤组织的体细胞胚诱导率与CK 组无显著差异，发育时期为35 d 的花药愈伤组织的体细胞胚诱导率较CK 组显著下降（P<0.05）；在子叶胚形成阶段，发育时期为21 d 花药愈伤组织的子叶胚数较CK 组显著提高（P<0.05），发育时期为0、28、42 d 的花药愈伤组织的子叶胚数与CK 组无显著差异，其余3 个发育时期的花药愈伤组织的子叶胚数较CK 组显著下降（P<0.05）、发育时期为0、21 d 花药愈伤组织的子叶胚获得率较CK 组显著提高（P<0.05），发育时期为7、14、28、42 d 的花药愈伤组织的子叶胚获得率与CK组无显著差异，发育时期为35 d 的花药愈伤组织的子叶胚获得率较CK 组显著下降（P<0.05）。

3 讨论

3.1 低温保存将全年花药愈伤供应时间从60d延长至240d

花药愈伤组织是良好的遗传转化受体，马来西亚[10-12]、印度[4]、我国[13]均通过转化花药愈伤组织获得了转基因植株。然而花药愈伤组织为脱分化愈伤组织，不能通过继代增殖，需不断采集外植体。橡胶树花期集中，不同地区橡胶树一年开花2～3 次，每次雄花花期20 d 左右。室外采集外植体的另一个问题是污染率与气候密切相关，白粉病高发季节外植体污染率高达50%以上，而晴天外植体污染率低于10%。因此在晴天采集外植体诱导愈伤组织，并通过物理化学方式限制其生长，延长愈伤组织供应时间对遗传转化研究具有重要意义。

限制生长保存的方式有降低培养环境的氧气含量、添加渗透调节剂或生长抑制剂、胶囊化或脱水、降低培养温度[14]，其中降低培养温度减慢细胞代谢活动的同时，存活率高、操作简单、方便，使用较多。橡胶树不同愈伤发育时期（0、7、14、21、28 d）、低温保存温度（15、20 ℃）可以延长花药初代愈伤供应时间15～60 d，子叶胚供应时间27～95 d。最优方案为发育时期为21 d 的花药愈伤在15 ℃低温下保存15 d，可延长花药愈伤和初代子叶胚供应60 d 和60～95 d，该处理虽然降低了46.61%愈伤数，但促进了子叶胚形成，子叶胚数提高了27.18%，达显著水平。说明以该处理低温保存的花药愈伤为侵染受体，在侵染量减少46.61%的情况下，其子叶胚数可提高27.18%，大大提高遗传转化工作效率。近年来，低温保存结合抗氧化剂、低含氧量等方法实现在胚性愈伤组织[15-16]、茎尖培养物[17]、花粉[18]、种子[19-20]、体细胞胚[21]、微型块茎[22]、带芽茎段[23]等组织、器官，植株[24]的中短期保存，保存温度在1～20 ℃，保存时间21 d 至18 个月。通过18 ℃+90 g/L 蔗糖+2 mg/L ABA+10 μmol/（m2·s）低光照可保存枣椰体细胞胚10 个月，存活率接近100%，体细胞胚增殖率高于室温[21]。通过4～5 ℃+抗氧化剂可保存橡胶树易碎胚性愈伤25 d，存活率与室温相近，且恢复后愈伤细胞活力更强，植株诱导率高于对照组50%，达显著水平[25]。但橡胶树易碎胚性愈伤组织诱导时间较长，再生植株生势弱，没有商业价值[8]。

3.2 低温保存适当发育时期花药愈伤促进了子叶胚形成

在15 ℃和20 ℃低温保存后，发育时期为21 d的花药愈伤子叶胚获得数和子叶胚获得率与对照组相比均有显著提高， 子叶胚数分别提高了27.18%和77.15%。子叶胚获得率分别提高了25.29%和15.58%。而35 d 的花药愈伤，15 ℃和20 ℃低温保存后，在愈伤发生阶段与对照组无显著差异，但在体细胞胚发生和子叶胚形成阶段与对照组差异显著，特别是子叶胚形成阶段，子叶胚获得数分别下降了82.85%和85.73%，子叶胚获得率分别下降了9.98%和7.97%，几乎无法获得子叶胚。橡胶树花药愈伤诱导和体细胞胚发生对温度非常敏感，在愈伤诱导和分化为球形原胚的过程，26 ℃体细胞胚数是24 ℃的2.86 倍，而在球形原胚发育为子叶胚的过程，24 ℃的体细胞胚数是22 ℃的1.60 倍，是28 ℃的1.25 倍，且28 ℃导致正常胚比例下降[26]。橡胶树花药愈伤诱导子叶胚经历5 步：外植体脱分化形成愈伤组织（0～21 d）、体细胞分化为胚性母细胞（21～28 d）、胚性母细胞经多次分裂为多细胞原胚（28～42 d）、多细胞原胚发育为球形胚（42～49 d）、球形胚进一步发育成子叶胚（52～72 d）[27]。因此，21 d 处于体细胞分化为胚性母细胞时期，此时进行低温处理，有助于筛选掉胚性弱或畸形的胚性母细胞，提高正常胚性母细胞比例，这些细胞在后续发育为子叶胚过程，少了畸形胚的竞争，营养供应更充分，因此，21 d 花药愈伤经低温处理后子叶胚数及子叶胚获得率大幅提高。而35 d 的花药愈伤处于多细胞原胚阶段，对温度非常敏感，推测低温不利于胚性母细胞发育为多细胞原胚，因此低温处理后，35 d 的花药愈伤体细胞胚数和子叶型体胚数及体细胞胚诱导率和子叶型体细胚诱导率大幅下降。低温提高正常胚比例在牡丹[28]、水曲柳[29]、大豆[30]、鸭茅草[31]也有发现。后续将通过解剖学进一步验证。

4结论

（1）在15 ℃和20 ℃低温保存15 d 后愈伤诱导、体细胞胚发生各阶段除胚性愈伤数显著低于对照组外，其余指标与对照组无显著差异，15 ℃低温保存各阶段指标均低于20 ℃，但差异不显著；（2）发育时期对低温保存后愈伤诱导、体细胞胚发生各阶段均有显著影响，对子叶胚形成阶段影响最大，其中21 d 花药愈伤组织经低温保存其子叶胚数量显著高于对照组，35 d 花药愈伤组织经低温处理后子叶胚数量显著低于对照组（P<0.05）。（3）15 ℃和20 ℃低温保存15 d 不同发育时期花药愈伤组织与对照组相比，可延长花药初代愈伤供应时间15～60 d，初代子叶胚供应时间27～95 d。最优方案为发育时期为21 d 的花药愈伤在15 ℃低温下保存15 d，可延长花药愈伤和初代子叶胚供应60 d 和60～95 d，该处理虽然降低了46.61%愈伤数，但促进了子叶胚形成，子叶胚数提高了27.18%。本研究实现了橡胶树花药愈伤的短期保存，有效解决了因花期短导致遗传转化受体来源不足的困难，全年3 个花季延长受体（花药愈伤）供应时间180 d，加上花季60 d，全年可开展实验时间由60 d 延长至240 d，有助于加快橡胶树花药愈伤遗传转化体系优化研究。