简化“探究抗生素对细菌的选择作用”的实验操作

摘 要：本文旨在探索并简化“探究抗生素对细菌的选择作用”的实验操作。首先进行预实验，探索菌种的选择和转接菌种条件对抑菌圈观测的影响，然后通过正式实验对比无菌环境和普通环境下操作实验的结果。笔者通过分析发现，抑菌圈的大小及变化与超净工作台上操作的结果差异不显著。通过对二者结果的对比和讨论，以期扩大“微生物培养”实验的开展范围。

关键词：抗生素；大肠杆菌；抑菌圈；普通实验桌；超净工作台

文章编号：1003-7586（2024）06-0062-04 中图分类号：G633.91 文献标识码：B

“探究抗生素对细菌的选择作用”是人教版普通高中教科书《生物学·必修2·遗传与进化》第6章第3节中的探究性实验，该实验可以帮助学生理解抗生素对细菌的选择作用，树立进化与适应观，对于发展学生的科学探究素养及将知识应用于解决实际问题的科学思维具有较大价值。但很多学校由于缺乏超净工作台、恒温培养箱等实验设备而无法开展该实验。因此本文旨在探索简化实验操作，让不具备“微生物培养”实验条件的学校也能开展该实验。

实验内容为：进行预实验，包括探索菌种的选择、转接菌种时能否用无菌水、污染是否会影响对抑菌圈的观测；进行正式实验，包括超净工作台与普通实验桌上操作的实验结果的比较，以期判断缺乏超净工作台和恒温培养箱的情况下能否及如何开展该实验。

1 实验材料和设备

1.1 实验菌种

大肠埃希氏菌（大肠杆菌）。

1.2 仪器设备

高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、移液枪、一次性吸液枪头、接种环、涂布器、培养皿、胶头滴管、记号笔、量尺、酒精灯、镊子、离心管。

1.3 实验试剂

无菌水、LB固体培养基、^［1］无菌滤纸片、头孢克肟药敏纸片（5 μg/片）、头孢他啶药敏纸片（30 μg/片）、阿莫西林药敏纸片（25 μg/片）、氧氟沙星药敏纸片（5 μg/片）。

2 实验原理和设计思路

2.1 实验原理

一般情况下，一定浓度的抗生素会杀灭细菌，但变异的细菌可能产生耐药性。在实验室连续培养的过程中，相应抗生素耐药细菌的比例可能会随之增加，因此通过测量并分析抑菌圈的直径变化，可推测细菌耐药基因频率的变化。

2.2 实验设计

实验设计思路如图1所示。

实验过程中简化实验操作：用胶头滴管代替移液枪；用普通实验桌代替超净工作台；转接菌种使用无菌水代替液体培养基；室温下培养代替恒温培养箱培养。

3 实验过程

3.1 问卷调查“药店抗生素类药物出售情况”

笔者走访泉州南安梅山镇区6家药店，调查后进行统计分析。调查结果为：抗生素是处方药；常1a1bc8d63355473bb94dc7b0d5f5373d见抗生素类有沙星类、青霉素类、头孢类等；购买量较多的是氧氟沙星、阿莫西林、头孢他啶、头孢克肟。因此本文以这4种抗生素来开展实验。

3.2 预实验

3.2.1 预实验目的

①筛选菌种：大肠杆菌、乳酸菌；②探明转接菌种时能否用无菌水；③探索微生物污染是否会影响对抑菌圈的观测。

3.2.2 预实验方案

设计4组实验：①大肠杆菌＋无菌水；②大肠杆菌＋无菌肉汤；③空白平板暴露于空气5 min；④乳酸菌＋无菌肉汤。均置于37℃下恒温培养3 d，每天定时观察菌落的生长情况。

3.3 正式实验

将超净工作台上的操作与普通实验桌上的操作进行比较。

3.3.1 超净工作台上操作

配制培养基，对培养基等实验用具进行高压蒸汽灭菌处理，对超净工作台喷洒75%的酒精，并开启紫外灯进行消毒后，在超净工作台上进行接种操作。在培养皿底部用记号笔进行划线分区并标注，取大肠杆菌菌种用无菌水稀释，用移液枪取200 μL的菌液涂布于平板上，在平板上放置无菌滤纸片和3个同一种抗生素的药敏滤纸片，重复3个平板，共做了4组不同抗生素的实验——头孢他啶、阿莫西林、氧氟沙星、头孢克肟，倒置在37 ℃恒温箱中培养8～10 h。记录抑菌圈的直径比，后选取抑菌圈边缘的细菌置于无菌水中，重复上述步骤，连续培养3代。

3.3.2 普通实验桌上操作

先对普通实验桌喷洒75%的酒精进行消毒，在培养皿底部用记号笔进行划线分区并标注，取大肠杆菌菌种并用无菌水稀释，用灭菌后的胶头滴管取2滴菌液涂布于平板上，并在平板上放置无菌滤纸片和3个同一种抗生素的药敏滤纸片，重复3个平板，共进行4组不同抗生素的实验，之后在室温条件下倒置培养8～10 h。测量抑菌圈的直径并记录，之后取抑菌圈边缘的细菌置于无菌水中，重复上述步骤连续培养3代。

实验结束后，将接种环、涂布器、胶头滴管、镊子、离心管及培养皿等用具进行灭菌，防止大肠杆菌扩散到环境中。

3.3.3 实验结果的记录

测量每一代大肠杆菌的抑菌圈直径并记录，同时与上一代进行比较，获取差值以及抑菌圈缩小百分比。抑菌圈缩小百分比=（上一代抑菌圈直径－当代抑菌圈直径）/上一代抑菌圈直径×100%。^［2］

4 实验结果及结论

4.1 预实验的结果如表1所示：

4.2 预实验的结论

大肠杆菌繁殖周期短，约为8 h左右，而空气中的杂菌、乳酸菌的繁殖周期均长于大肠杆菌。因此在72 h内，如果培养基受空气中杂菌污染，大肠杆菌仍是优势菌种，不影响抑菌圈的观察。

4.3 正式实验的结果

在普通实验桌和超净工作台上操作的4种抗生素对大肠杆菌所形成的抑菌圈比较如图2所示，其抑菌圈直径大小的比较及前后代抑菌圈的直径缩小值、抑菌圈缩小百分比如表2、表3所示。

4.4 正式实验的结论

本实验研究结果表明，不同抗生素对大肠杆菌的抑菌效果不同，普通实验桌的结果显示：氧氟沙星＞头孢他啶＞头孢克肟＞阿莫西林；超净工作台实验结果显示：头孢他啶＞氧氟沙星＞头孢克肟＞阿莫西林。笔者推测在普通实验桌和超净工作台上操作得到的抑菌圈大小差异可能与接种的菌液量大小有关，由于胶头滴管无法精确量取菌液，导致在两个平台上操作时量取的菌液量不同。大肠杆菌对不同抗生素的耐药性存在差异，且随抗生素使用频率的增加，其耐药性逐代增强。

对比结果显示：在普通实验桌上操作也可以得到明显的抑菌圈，且与超净工作台上无菌操作得到的结果差异不大。所以具有高压蒸汽灭菌锅的学校就能够开展该实验。

5 小结与讨论

大肠杆菌繁殖周期短，通常在8 h左右，该时间显著短于空气中杂菌的繁殖周期。因此在实施“探究抗生素对细菌的选择作用”实验的过程中，如果培养基受空气中杂菌污染，大肠杆菌仍是优势菌种，不影响对其抑菌圈的观测。因此具有高压蒸汽灭菌锅的学校可以带领学生在普通实验桌上实施该实验，用胶头滴管取液，转接菌种时用无菌水稀释，室温下培养即可。该实验有助于学生理解抗生素对细菌的选择作用，并帮助其树立进化与适应观。

参考文献

［1］施大华，申定健.“探究抗生素对细菌的选择作用”实验拓展设计［J］.生物学教学，2020，45（11）：47-49．

［2］李毅，王秀红.“探究多种抗生素对连续传代细菌的选择作用”实验创新性设计［J］.生物学教学，2021，46（8）：63-64．