甜瓜抗枯萎病资源筛选及抗病生理指标相关性分析

摘" " 要：为明确黑龙江地区甜瓜枯萎病生理小种，探究枯萎病胁迫下甜瓜生理指标变化，完善甜瓜枯萎病抗病评价体系，利用表型鉴定结合分子标记辅助选择（MAS，marker-assisted selection）对24份甜瓜资源进行抗病筛选。结果表明，黑龙江省尖孢镰刀菌甜瓜专化型Fm-1为1号生理小种。分子标记辅助选择共筛选出抗病资源15份，感病资源9份，具有较高的筛选效率。其中野生型资源1314抗性最强，发病率仅为10%；栽培种22-152的感病程度最高。利用筛选的两个抗性极端材料在幼苗期接种病原菌并于根部取样，测定抗病生理指标并进行相关性分析。结果表明，枯萎病胁迫下的抗病和感病材料生理指标响应差异显著，过氧化氢酶（CAT）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性与发病率呈极显著负相关；丙二醛含量和相对电导率与发病率呈极显著正相关。综上，利用功能性分子标记可在早期实现精准筛选甜瓜抗枯萎病品种，相对电导率和CAT及PAL活性可作为抗枯萎病评价的首选指标。

关键词：甜瓜；枯萎病；抗病资源筛选；生理指标测定；相关性分析

中图分类号：S652 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）07-059-08

Screening of melon resources resistant to Fusarium wilt and correlation analysis of physiological indexes of disease resistance

LIU Tai， WANG Di， XU Huichun， DU Zhiqiang， HU Xixi， ZHANG Ling， CHE Ye， QI Wenju

（Daqing Branch， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Daqing 163711， Heilongjiang， China）

Abstract： In order to identify the physiological race of melon Fusarium wilt in Heilongjiang province， and improve the evaluation system of melon Fusarium wilt disease resistance， 24 melon varieties were screened for disease resistance using phenotype identification combined with marker-assisted selection（MAS）. The results showed that the specific type Fm-1 of Fusarium oxysporum from Heilongjiang province was physiological race No. 1. A total of 15 resistant resources and 9 susceptible resources were screened by marker-assisted selection with high screening efficiency. The wild-type resource 1314 had the most resistant， the incidence of which was only 10%. The cultivated-type 22-152 had the highest degree of infection. Two resources with extreme resistance were inoculated with pathogens at seedling stage and sampled at root. The physiological indexes of resistance were determined and the correlation analysis was carried out. The results showed that the physiological indexes of resistant and susceptible materials were significantly different under wilt stress， and the activities of catalase（CAT）， phenylalanine aminolyase（PAL）， superoxide dismutase（SOD）and peroxidase（POD）were significantly negatively correlated with incidence rate. Malondialdehyde content and relative conductivity were significantly positively correlated with incidence rate. In conclusion， functional molecular markers can be used to accurately screen melon varieties resistance to Fusarium wilt at an early stage， and relative conductivity and CAT and PAL activities can be used as the preferred indicators for evaluation of Fusarium wilt resistance.

Key words：Melon; Fusarium wilt; Screening of resistant resources; Physiological index determination; Correlation analysis

甜瓜（Cucumis melo L.）是葫芦科甜瓜属一年生蔓性草本植物，具有极高的营养价值和经济价值[1]。随着设施园艺栽培技术的推广，由尖孢镰刀菌甜瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. melonis）引起的枯萎病愈发严重，制约着世界范围内甜瓜生产和优质新品种选育[2]。枯萎病在甜瓜全生育期均可发生且传播速度极快，具有极强的传染性和较高的致死率，对甜瓜产量和品质造成严重影响[3-4]。相关研究表明，植物的抗病性与组织结构和防御酶活性等因素有着十分密切的关系[5]，特别是超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）等防御酶活性对病害响应差异较大[6]。枯萎病菌侵染后，各级抗性植株体内的抗氧化酶活性会出现不同程度的提高以快速清除由病害胁迫所产生的过量超氧自由基[7-11]。植株在枯萎病胁迫下所产生的超氧自由基诱导脂质中的不饱和脂肪酸发生过氧化作用是造成细胞损伤的主要原因，而丙二醛（MDA）作为膜脂过氧化的主要产物之一，直接反映了细胞的脂质过氧化水平和生物膜损伤程度。同时，损伤的膜结构通透性增大，电解质外渗，从而导致细胞浸提液的相对电导率（REC）增高。因此，MDA含量和REC可作为衡量植物抗病性的重要指标[12-13]。

甜瓜具有丰富的基因型和复杂的抗病遗传机制。自1976年Risser等[14]首次发布甜瓜抗尖孢镰刀菌基因Fom-1和Fom-2后，截至目前共发现了5个抗枯萎病基因[15-17]。其中，研究较为深入的基因有Fom-1、Fom-2和Fom-3，目前已成功将Fom-1和Fom-2基因进行了克隆[18-19]。不同甜瓜品种中所含有的抗病基因不同，对尖孢镰刀菌各生理小种的抗性也有所差异。目前已经鉴定出4个生理小种，分别为小种0、1、2和1.2[16，18-20]。品种Doublon和Hemed含有抗病基因Fom-1，抗甜瓜枯萎病专化型生理小种0和2，感生理小种1和1.2；品种CM17187和Makdimon-1含有抗病基因Fom-2，抗生理小种0和1，感生理小种2和1.2；品种MR-1、Top Mark和Perlita FR含有抗病基因Fom-3，抗生理小种0、1和2，感生理小种1.2[14，16，21-22]。以遗传物质中核苷酸差异为基础的DNA标记是不同生物品种在分子水平上的直接反映。自20世纪RFLP标记技术用于检测品种间遗传变异多态性以来，SSR、CAPS、As-pcr等各种标记方式都逐步应用到了甜瓜的抗病分子育种实践中。凌悦铭等[23]利用高抗和高感霜霉病甜瓜品种为亲本构建F2代分离群体，基于BSA-seq结果开发了许多Indel标记，可用于区分抗病品种。王士伟[24]基于抗病和感病甜瓜材料Fom-2基因的LRR区单碱基差异，开发出功能性分子标记，可较为精准地筛选抗病品种。

针对当前黑龙江地区甜瓜枯萎病生理小种的研究较少，且基于甜瓜遗传背景的复杂性和基因型的多样性，进一步完善甜瓜抗枯萎病鉴定评价体系对抗枯萎病甜瓜资源的筛选及选育抗病品种具有重要意义。笔者利用国际通用鉴别寄主在甜瓜幼苗期接种枯萎病菌，鉴定黑龙江地区枯萎病生理小种，利用表型鉴定结合分子标记辅助选择技术对24份甜瓜资源的抗病性进行鉴定，同时利用筛选的高抗和高感品种对抗病生理生化指标进行测定和相关性分析，探索CAT、PAL、SOD和POD活性以及MDA含量和REC与甜瓜抗病性的关系，进一步完善甜瓜抗枯萎病评价体系，以期为丰富甜瓜抗病种质资源库和甜瓜抗枯萎病育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参试的24份甜瓜资源包含厚皮甜瓜西州密25号、金香翠蜜、22-178、22-173、22-128、22-138、22-155、22-165、22-176、22-172，薄皮甜瓜甘一美香、争春二号、泽甜豹纹、泽甜早香蜜、泽甜翠苹果、22-166、22-152、22-175、22-120、22-122、22-140、22-114、22-106和1份野生型资源1314。其中，西州密25号由河北粒尔田种业有限公司提供，金香翠蜜由大庆萨中种业提供，甘一美香、争春二号、泽甜豹纹、泽甜早香蜜、泽甜翠苹果由齐齐哈尔泽甜种业有限公司提供，其他资源为黑龙江省农业科学院大庆分院自主选育的高世代自交系。甜瓜幼苗皆种植于黑龙江省农业科学院安达育种基地，设置随机区组试验。每份资源设3次生物学重复，各重复选取长势一致的植株20株。待植株成长至两片真叶期进行接菌观察。

1.2 试验方法

1.2.1" " 枯萎病病原菌生理小种鉴定" " 参试病原菌菌株为2023年6月在黑龙江省农业科学院安达育种基地甜瓜病根分离获得的尖孢镰刀菌（F. oxysporum）Fm-1，全试验过程均在HDL超净工作台中进行。为了保证病原菌的致病性并确定参试菌株的生理小种，笔者以4个国际通用生理小种鉴别寄主为试材，分别为 Charentais T、Doublon、CM17-187 和 MR-1，由黑龙江省农业科学院园艺分院提供。不同鉴别寄主对生理小种的抗感性反应见表1[25]。

1.2.2" " 甜瓜抗枯萎病筛选试验" " 2023年6月，挑选各品种饱满种子25粒于安达育种基地内进行催芽育苗。2023年7月将分离获得的尖孢镰刀菌菌株在PDA培养基上活化复苏，菌种复苏后用无菌水将菌液稀释至 1×106个·mL-1，用于接种。2023年7月中旬，待植株长至两叶一心时挑选长势一致的植株，使用蘸根法接菌。植株接种后置于接种室，室内昼夜（16 h/8 h）交替，温度为26 ℃/20 ℃。在接菌10 d后统计发病情况，参考刘朋义等[5]的方法对植株进行病情分级，统计病情指数和品种抗性。病情指数计算公式如下：

DI=∑（SiNi）/4N×100；" " " " " " " " " " " " " " " " " " （1）

发病率（R）/%=发病株数/接种总株数×100。（2）

式中，DI为病情指数，Si为发病级别，Ni为相应发病级别的株数，i为病情分级的各个级别，N为调查总株数。

对枯萎病抗性评价参考顾卫红[26]的评价标准（表2）。

1.2.3" " 分子标记辅助选择" " 参考王怀松等[27]的方法提取植物基因组DNA。试验所使用的分子标记为王士伟[24]开发的FOM-2功能性分子标记，正向引物2-3F1：5'-GTGTAACACAAATTCCTCAACA-3'，反向引物2-3R1：5'-GTGTAACACAAATTCCTCATCA-3'，以样本DNA为模板，用AS-pcr（Allele-specific pcr）法筛选抗病、感病品种，扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；62 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；72 ℃后延伸10 min，共35个循环。最终产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4" " 生理指标测定" " 接种处理和未接种对照（CK）在相同时间点取根部样本进行生理指标检测。取样时间为接种前（0 d）， 接种后每隔1 d取样，连续 5次，设3次重复。按照南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书进行POD、SOD、CAT 活性和 MDA 含量的测定。使用上海博耀生物科技有限公司的酶联免疫分析（ELISA）试剂盒测定PAL活性。用酶标仪在450 nm波长下测定光密度（D450 nm），通过标准曲线计算样品中的酶活性。以每分钟光密度变化0.01所需酶量为1个酶活性单位（U）。参考Alpaslan的方法[28]，采用电导率仪测定相对电导率。

1.3 数据分析

数据表示为3次独立重复的平均值±SD，采用SPSS 26.0统计软件进行统计分析，同一甜瓜材料相同时间点接种处理与未接种对照生理指标采用Microsoft Excel进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 病原菌生理小种鉴定

笔者利用国际通用鉴别寄主对参试病原菌的抗感情况进行鉴定，详见表3。根据枯萎病的接种方法，利用尖孢镰刀菌Fm-1对各鉴别寄主进行接种，5 d后调查病情指数。Charentais T和Doublon的病情指数分别为98.67和83.73，属于高度感病；CM17-187病情指数为12.5，属于高抗品种；MR-1病情指数为23.63，属于抗病品种。根据表1中不同鉴别寄主对不同生理小种的接种鉴定反应，黑龙江地区尖孢镰刀菌Fm-1属于生理小种1号。

2.2 病情指数及发病率

24份甜瓜资源对枯萎病的抗性鉴定结果见表4，有15份材料表现抗性，其中4份材料表现高抗（HR），即1314、22-122、22-138和22-173；抗病（R）和中抗（MR）品种11份。野生型甜瓜资源1314的病情指数及发病率在供试材料中均最低，分别为8.4和13.33%，显著低于其他资源。感病（S）材料6份，高感（HS）材料3份；其中栽培种甜瓜22-152的病情指数及发病率最高，分别为85.67和96.67%，显著高于其他资源。由表4数据可知，病情指数与发病率呈正相关，变化趋势基本一致。

2.3 分子标记辅助选择技术筛选抗性品种

利用功能性分子标记辅助选择体系，以24份甜瓜资源DNA为模板，采用As-pcr扩增技术，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。结果（图1）表明，15个品种扩增出清晰条带，说明含有抗病基因Fom-2，推测为抗病品种；9个品种未扩增出目标条带，说明不含Fom-2抗病基因，推测为感病品种。

2.4 生理指标分析

酶活性测定结果表明，抗病资源1314和感病资源22-152的CAT活性整体呈升高趋势（图2-A），接菌后5 d，1314的CAT活性达到峰值，是CK的2.72倍；22-152同时也达到最高值，是22-152 CK的2.23倍。枯萎病菌侵染诱导根部CAT活性升高，抗病品种的CAT活性在侵染第5天显著高于感病品种，抗氧化能力增强。接菌后，抗病品种1314和感病品种22-152的PAL活性也呈上升趋势（图2-B）。接种后5 d，1314的PAL活性是CK的3.19倍，1314与22-152的PAL活性在5 d时差异最大，抗病资源比感病资源的PAL活性显著提高40.15%。

1314和22-152在接菌后5个时期的SOD活性呈先升高后降低的变化趋势（图2-C）。在接菌初期，1314的SOD活性略高于22-152，相差较小。在接菌2 d时，1314的酶活性迅速升高并于第3 天达到峰值，比同期的22-152提高6.89%；而感病资源的SOD活性达到峰值的时间略迟，且低于抗病资源。POD活性在抗感病资源间的变化与SOD基本相似，呈先上升后下降的变化趋势（图2-D）。抗病资源1314的POD活性在接菌后第3天达到峰值，为同期CK的2.24倍。值得注意的是，在监测全过程中抗病资源的POD活性大多高于感病资源，且二者的差异在接菌后3 d最大，1314的POD活性比22-152显著提高30.12%。

抗病和感病资源在CK和接菌处理下的MDA含量差异显著（图2-E）。两份材料接菌后MDA含量呈上升趋势且均高于相应的CK。感病资源22-152在接菌4～5 d时的MDA含量超过1314，并在5 d时达到峰值，比抗病资源提高8.69%。总体来看，感病资源感染病菌后细胞膜脂过氧化更严重，MDA含量随感病程度加重而升高。感病资源的相对电导率随病情程度加重呈上升趋势，在接菌5 d时，22-152的相对电导率达到最高，比接菌的1314提高37.17%；而抗病资源1314接菌后的相对电导率变化幅度较小（图2-F），表明抗病资源在病原菌侵染后具有更强的细胞稳定性。

2.5 生理指标与抗病性相关性分析

各生理指标与甜瓜对枯萎病抗性的相关性分析结果如表5所示，各生理指标与发病率间均存在极显著相关性，其中，CAT、PAL、POD和SOD活性与发病率呈极显著负相关；MDA含量和相对电导率则与发病率呈极显著正相关。相对电导率、CAT活性、PAL活性与发病率的相关系数绝对值较高，分别为0.983、0.979和0.974，因此在建立甜瓜抗枯萎病评价系统时，可将这3个生理指标作为首选测定参数。

3 讨论与结论

植物在正常生理代谢活动中细胞器、脂膜会产生如H2O2等活性氧物质（ROS）[29]。而枯萎病病菌侵染等胁迫条件下会打破植物细胞内ROS的代谢平衡，使其大量累积引发膜脂过氧化作用，从而使膜系统丧失完整性，引起电解质外渗，最终形成植物细胞膜脂过氧化产物MDA，过量MDA会伤害甜瓜细胞和组织，导致植株黄化、枯萎，严重时甚至会导致植株死亡[30-31]。因此在植物抗性生理研究中，MDA含量与相对电导率通常作为衡量膜脂过氧化作用的指标[32-33]。在本研究中，相对电导率与发病率呈极显著正相关，其数值随感病程度加重而明显升高，相关系数较大，可在后续研究中作为衡量感病程度的重要指标。

甜瓜在胁迫条件下所产生的过量ROS对脂膜造成的损伤称为过氧化损伤，然而植物细胞中也形成了一系列抗氧化机制来维持细胞相对稳定性。SOD催化超氧离子发生歧化反应产生H2O2，随后被POD、CAT清除[34]。丁玉梅等[35]研究表明，枯萎病影响下的抗病南瓜品种主要依赖SOD、POD和CAT来清除体内的活性氧。不仅如此，与感病品种相比，抗病南瓜还具有更高效的分子调控机制以维持高水平的抗氧化酶活性。笔者以抗感资源在枯萎病诱导下的抗氧化酶活性指标为依据，发现抗病资源1314在接菌后，SOD、CAT、POD反应迅速，可以快速形成抗氧化机制，而感病资源22-152的抗氧化机制在反应时间和活性水平上均长于或低于抗病资源。

PAL是植保素、木质素、酚类物质合成的关键酶，活性与酚类化合物的合成密切相关，在植物抗病、抗虫、抗逆境胁迫等方面也起着重要作用[36]。研究表明，在枯萎病胁迫下，西瓜叶片PAL活性显著升高，且抗病品种酶活性峰值出现早于感病品种。Sadeghpour等[6]测定了甜瓜枯萎病高抗品种Shante-F1和感病品种Shahabadi在接菌后PAL等8种抗氧化酶的活性变化，结果表明，抗病相关基因的上调表达是甜瓜抗病性的关键因素。Madadkhah等[37]测定了45份甜瓜种质在接菌后根部的CAT和PAL活性等指标，结果表明，抗病和感病品种的酶活性在接菌后都有不同程度的升高，但抗病品种要显著高于感病品种；研究同时发现，酶和酚类物质在诱导甜瓜增强抗性方面发挥重要作用。在本研究中，枯萎病胁迫下甜瓜的PAL和CAT活性随着感病时间总体呈上升趋势，比CK均有大幅提高，且抗病资源PAL活性显著高于感病资源，与前人的研究结果一致。在相关性研究结果中发现，CAT和PAL活性与抗病程度有较高的相关性，可以与相对电导率共同作为判断品种抗病能力的重要指标。

甜瓜具有丰富的基因型和复杂的抗病调控机制，因而借助表型鉴定与分子标记相结合的方式能够获得较为准确的评价结果。邵元健等[38]利用Fom-2基因双侧连锁分子标记SSR430和STS296对甜瓜品种资源Fom-2基因的携带情况进行分子鉴定，结果发现，标记准确率为93.3%，能够较为准确地筛选含有主效抗病基因的甜瓜品种。赵玉龙[39]根据MR-1和WI998的重测序结果，针对Fom-2的SCOP结构功能域的核苷酸序列进行扩增，开发出与Fom-2紧密连锁的CAPS分子标记，获得了较高的田间数据符合率。笔者参考王士伟[24]开发的分子标记，进行不同甜瓜资源的枯萎病抗性鉴定。然而，基于甜瓜抗病分子调控机制的复杂性，将分子标记直接应用于生产中还有待进一步研究。邵元健等[38]研究发现，基于Fom-2分子标记预测的15个感病基因型甜瓜品种中实际发病的仅过半数，能够证明其不含抗枯萎病主基因Fom-2；而对于研究中的抗病品种仅说明其不携带Fom-2基因，但存在其他抗病基因参与调控。如Dolton和Canta loupe chaudo所携带的抗枯萎病基因为Fom-1；感病品种黄元帅两侧标记基因型为抗病型，可能是由于双侧标记间的染色体发生过双交换，使抗病基因被交换[38]。笔者在本研究所使用的分子标记针对抗枯萎病Fom-2基因所介导的枯萎病0号和1号生理小种具有较高的筛选效率，在植株生长初期便可检测其对1号生理小种的抗性，为丰富黑龙江地区抗病甜瓜品种资源提供了更为便捷的检测方法。

综上所述，笔者利用国际通用鉴别寄主对黑龙江地区枯萎病生理小种进行鉴定，最终认为研究所分离纯化的尖孢镰刀菌菌株Fm-1为枯萎病1号生理小种。表型鉴定结果表明，24份资源中有4份高抗资源，抗病和中抗资源11份，感病资源6份，高感资源3份。分子标记辅助筛选最终获得15份抗病资源，9份感病资源，具有较高的筛选效率。试验通过对比高抗资源1314和高感资源22-152的6项生理指标，发现各指标对病害响应强烈且抗病资源防御酶活性均高于感病资源，而MDA含量和相对电导率在抗、感病资源中的差异较为显著，与发病率呈极显著正相关。通过对各项生理指标与发病率的相关性进行分析，相对电导率、CAT和PAL活性3项指标的相关系数绝对值较高，可作为衡量甜瓜抗病性的首选指标。

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收稿日期：2023-10-31；修回日期：2024-01-10

基金项目：黑龙江省农业科技创新跨越工程优青项目（CX22YQ32）；黑龙江省农业科技创新跨越工程农业特色产业项目（CX23TS11）；黑龙江省农业科学院院级课题（DQ-ZD-001）

作者简介：刘" " 泰，男，助理研究员，研究方向为西甜瓜分子遗传育种。E-mail：2250339510@qq.com

通信作者：王" " 迪，男，研究员，研究方向为蔬菜栽培生理与品质调控。E-mai：dqnkywd@hotmail.com