南瓜白粉病拮抗内生细菌BacilluscereusB4-2的分离鉴定及生防效果

摘 " "要：从高抗白粉病的南瓜植株内分离筛选出对南瓜白粉病有较好防治效果的内生拮抗细菌菌株，为南瓜白粉病的生物防治提供新途径。采用孢子萌发抑制法、叶盘漂浮法和温室盆栽试验筛选出有较好防效的内生细菌，用形态观察、生理生化测定和分子生物学方法进行鉴定。结果表明，从高抗白粉病的南瓜自交系22G3植株内分离获得29株内生拮抗细菌菌株，5个菌株对南瓜白粉菌的孢子萌发抑制率在50%以上，其中菌株B4-2对白粉菌的孢子萌发抑制率最高，为88.65%。叶盘和室内盆栽试验结果均表明，菌株B4-2对南瓜白粉病的防治效果最好，防治效果分别达79.58%和83.21%。不同稀释倍数的B4-2发酵液对南瓜白粉病均有一定的防治效果，随着稀释倍数的增大，防治效果降低，其中菌株B4-2发酵液原液对南瓜白粉病的防治效果最好，达82.14%。通过形态特征、生理生化特征及基因序列分析，鉴定菌株B4-2为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。综上所述，蜡样芽孢杆菌B4-2能较好地防治南瓜白粉病，有一定的开发潜力。

关键词：南瓜；白粉病；蜡样芽孢杆菌；生物防治；防治效果

中图分类号：S642.1 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）08-051-06

Isolation and identification of endophytic Bacillus cereus B4-2 against pumpkin powdery mildew and effect of biological control

LI Yali， QI Liben

（Vegetable Institute， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730070， Gansu， China）

Abstract： In order to find the new biological control method against pumpkin powdery mildew， this experiment screened the endophytic antagonistic bacteria against pumpkin powdery mildew from high resistance plants. The spore germination inhibition method， leaf disk floating method and greenhouse pot experiment method were used to select endophytic bacteria with good control effect， which was identified by morphological observation， physiological and biochemical determination as well as molecular biology method. The results showed that 29 endophytic antagonistic bacterial strains were isolated from the high resistant pumpkin inbred line 22G3. Among them， 5 strains had an inhibition rate of over 50% on the spore germination of powdery mildew， and B4-2 had the highest inhibition rate of 88.65%. Both leaf disc and potting experiments showed that the strain B4-2 had the best control effect on pumpkin powdery mildew， with the control effects of 79.58% and 83.21%， respectively. All the different dilution ratios of B4-2 fermentation had certain control effects on pumpkin powdery mildew. As the dilution ratio increased， the prevention effect decreased. The prevention effect of original B4-2 solution was the best and was 82.14%. B4-2 was identified as Bacillus cereus by morphological， physiological， biochemical and gene sequence analysis methods. In summary， B. cereus B4-2 can effectively control pumpkin powdery mildew， which has certain potential for development.

Key words： Pumpkin; Powdery mildew; Bacillus cereus; Biological control; Control efficiency

南瓜是葫芦科一年蔓生草本植物，是我国重要的蔬菜之一。南瓜富含蛋白质、维生素、多糖和人体必需氨基酸、β-胡萝卜素、钙、铁、磷等，有很高的营养价值和保健功能，有广阔的开发前景和较高的利用价值[1]。白粉病是南瓜生产中最重要的病害之一，具有潜伏期长、发病迅速、繁殖快等特点。防治不及时可造成减产甚至绝收，可对南瓜的品质和产量造成严重的影响[2]。

植物内生菌是指在植物生活史的部分阶段，生活于健康植物的各种组织和器官内部且没有引起植物组织明显病症的微生物，包括内生细菌、内生真菌和内生放线菌[3-5]。已知所有植物物种中均有内生菌的存在[6-7]。目前，普遍认为内生细菌是从经过严格表面消毒的植物组织中分离出来的，与宿主植物具有共生关系且没有对植物造成明显损害的细菌[8-9]。由于很多内生细菌对植物没有损伤且有拮抗病原菌的作用，所以常常被用于植物病害的生物防治[10-11]。生物防治以其安全、高效及无污染等特点已经成为植物病害防治的重要途径。目前，用于防治金银花、小麦和甜瓜白粉病的内生细菌已有报道[12-14]。但利用内生细菌防治南瓜白粉病的报道较少。笔者的研究旨在从高抗南瓜白粉病的植株内分离筛选出对该病害有较好防效的菌株，以期为南瓜白粉病的生物防治探寻新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

南瓜白粉病病原菌为单囊壳白粉菌（Podosphaera xanthii）2France生理小种。南瓜抗病自交系22G3用于内生细菌的分离，室内盆栽试验材料为南瓜感病自交系22H6。以上材料均由甘肃省农业科学院蔬菜研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 内生细菌的分离、纯化及其发酵液的制备 2023年6月，在甘肃省农业科学院蔬菜研究所育种基地采集高抗白粉病的南瓜自交系22G3植株，取适量的根、茎、叶剪碎，在75%乙醇中浸泡1 min，放入0.1%HgCl2中浸泡60 s，再放入75%乙醇中浸泡30 s，将组织取出后用无菌水冲洗4次。在灭过菌的研钵内加入10 mL无菌水和少量无菌石英砂研磨成匀浆，静置30 min，将0.1 mL匀浆均匀涂抹在NA平板上，置于28 ℃恒温箱中培养48 h。选取不同的菌落在NA平板上进行纯化，将纯化的细菌菌株保存在NA斜面，置于4 ℃冰箱保存备用。将保存的细菌菌株接种在装有100 mL NB液体培养基的250 mL三角瓶中，在摇床上培养48 h（170 r·min-1，28 ℃），得到的发酵液用灭菌水适量稀释后，采用平板菌落计数法将原液制成含量为108 cfu·mL-1 的发酵液。以上试验均在无菌环境条件下进行。

1.2.2 初筛试验 初筛试验采用孢子萌发抑制法。将无菌NA培养基平板用灭过菌的打孔器切成直径为0.5 cm的圆饼，放入预先制备好的各菌株发酵液中浸泡4 h，对照为无菌水浸泡的培养基圆饼，在菌饼中加入20 μL的病原孢子悬浮液（107 个·mL-1），完全随机放入灭菌培养皿中，每皿5个菌饼，盖上培养皿盖置于光照培养箱（25 ℃，光照16 h·d-1，相对湿度80%）中培养48 h，每处理3次重复。镜检并计算孢子萌发抑制率。

1.2.3 复筛试验 （1）叶盘复筛试验 " "对初筛试验效果明显的菌株进行叶盘复筛试验。用直径1 cm的打孔器从健康22H6幼叶上切下叶盘，在内生细菌发酵液（108 cfu·mL-1）中浸湿后晾干，对照为无菌水浸泡的叶盘，正面朝上悬浮在加有苯胼咪唑（25 mg·L-1）的无菌水表面，在叶盘上加入50 μL的病原孢子悬浮液（107个·mL-1），盖上培养皿盖置入光照培养箱（22 ℃，光照16 h·d-1，相对湿度80%）。随机选择5个叶盘为1个处理，3次重复。7～10 d 后调查病斑面积，并计算病情指数和防治效果。南瓜白粉病叶面病情分级标准[15]：0级，叶片无病斑；1级，病斑面积占叶面积的5%以下；3级，病斑面积占叶面积的5%～15%；5级，病斑面积占叶面积的16%～25%；7级，病斑面积占叶面积的26%～50%；9级，病斑面积占叶面积的51%～75%；11 级，病斑面积占叶面积的76%以上。

病情指数=∑（病级株数×代表级数）/（调查总株数×最高级值）×100；

防治效果/%=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100。

（2）室内盆栽复筛试验 将预先制备好的内生细菌发酵液（108 cfu·mL-1）喷洒在22H6 2叶1心期幼苗叶片上，以喷灭菌水为对照，24 h后接种南瓜白粉病菌孢子悬浮液（107个·mL-1），20～24 ℃下保湿24 h。每处理5株幼苗，3次重复，随机区组排列。7～12 d后调查病情并按公式计算病情指数和防治效果。

1.2.4 拮抗菌株温室防病效果的测定 取22H6 2叶1心期幼苗，分别用拮抗菌株原液（108 cfu·mL-1）和稀释10倍、100倍、1000倍液喷雾，以喷灭菌水为对照，每株15 mL，24 h后接种南瓜白粉病菌孢子悬浮液（107个·mL-1），20～24 ℃下保湿24 h。每个处理5株，3次重复，随机区组排列。7～12 d后调查病情并计算防治效果。

1.2.5 拮抗菌株B4-2的鉴定 采用形态观察、生理生化测定和系统发育树分析方法，对拮抗内生细菌菌株进行鉴定。将拮抗菌株在NA培养基上划线，28 ℃恒温培养2 d，观察菌落形态、颜色和大小，利用透射电镜观察菌体形态，同时参考《常见细菌系统鉴定手册》[16]，进行厌氧试验、革兰氏染色、硝酸盐还原、柠檬酸盐利用、V-P试验、葡萄糖、溶菌酶肉汤、动力培养基、明胶试验、过氧化氢酶、淀粉水解和甘露醇的生理生化特征分析。采用50 μL的PCR反应体系进行16S rDNA的扩增、测序及系统发育树分析。使用细菌DNA提取试剂盒提取拮抗菌株基因组DNA。扩增菌株的16S rDNA采用细菌通用引物27F（5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′- GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR扩增体系（50 μL）：DNA模板4 μL，上、下游引物各 2 μL，mix 25 μL，ddH2O 17 μL。PCR 扩增程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。扩增产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测，16S rDNA测序工作由甘肃科美意生物科技有限公司完成。将所测菌株的16S rDNA序列上传Ezbiocloud 网站进行比对，构建系统发育树，分析与模式菌的亲缘关系。

1.3 数据分析

利用Microsoft Excel 2010 和 SPSS 20.0 软件对试验数据进行统计及差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 拮抗内生细菌的分离及其对孢子萌发的影响

根据菌落大小、颜色和形态的不同，从南瓜高抗白粉病自交系22G3的根、茎、叶部共分离纯化到29株内生细菌，其中叶部13株，编号为B，茎部6株，编号为ZB，根部10株，编号为HB。表1结果表明，内生细菌B4-2、ZB3-1、HB3-6、HB3-2、B5-1对南瓜白粉病菌分生孢子萌发的抑制率均在50%以上，其抑制率分别为88.65%、72.33%、65.22%、63.47%和57.10%，其中B4-2的抑制率最高。

2.2 叶盘试验的防治效果

对上述试验筛选得到的5株内生细菌B4-2、ZB3-1、HB3-6、HB3-2和B5-1进行南瓜白粉病的叶盘防效试验。表2结果表明，5个菌株对南瓜白粉病均有一定的防治效果，且与对照差异显著。其中，B4-2防治效果最好，病情指数仅为18.21，防效达79.58%。从图1可以看出，经过B4-2发酵液处理的叶盘病斑面积明显小于对照。

2.3 室内盆栽试验的防治效果

对筛选出的内生细菌进行室内盆栽防治效果试验。表3结果表明，内生细菌B4-2、ZB3-1、HB3-2、HB3-6和B5-1处理南瓜幼苗后，白粉病病情指数分别为14.90、33.25、38.61、41.74和44.52，且与对照均差异显著。其中，菌株B4-2在南瓜白粉病室内盆栽试验中防效最好，病情指数仅为14.90，防治效果达83.21%。从图2可以看出，经B4-2发酵液处理过的南瓜幼苗病斑面积明显小于对照。

2.4 菌株B4-2不同稀释倍数发酵液对南瓜白粉病的室内防治效果

对南瓜白粉病有显著防治效果的B4-2发酵液原液和稀释10倍、100倍、1000倍液喷雾南瓜幼苗。表4结果表明，不同稀释倍数的菌株B4-2发酵液对南瓜白粉病均有一定的防治效果，随着稀释倍数的增大，防治效果逐渐降低。喷施B4-2发酵液原液，南瓜白粉病的病情指数最低，仅为15.63；防治效果最好，达82.14%。

2.5 菌株B4-2的鉴定

NA培养基上的菌落大，圆形或近似圆形，直径5～7 mm，扁平，表面粗糙稍有光泽，质地软，淡黄色。经过较长一段时间的培养后，该菌落的表面开始呈现毛玻璃状。菌体杆状，末端方，短或长链，兼性好氧。除淀粉水解和甘露醇试验为阴性外，革兰氏染色、硝酸盐还原、柠檬酸盐利用、V-P试验、葡萄糖、溶菌酶肉汤、动力培养基、明胶试验和过氧化氢酶生理生化指标均为阳性（表5）。

将拮抗内生细菌菌株B4-2的16 S rDNA序列在 Ezbiocloud 网站上进行比对并构建系统发育树，图3结果表明，菌株B4-2与蜡样芽孢杆菌（登录号为CP026678.1）的同源性最高，序列一致性达99.72%。结合形态、生理生化特征鉴定菌株B4-2为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。

3 讨论与结论

生物防治可有效降低农药残留及对环境的污染，且对植物病害有一定的控制作用。近年来，生防菌株的获得与应用加快了生物防治的进程[17]。内生细菌是植物体内种类和数量最多的微生物，在植物的各个组织器官中均可分离获得。它不受植物附生细菌的影响，利用植物的独特生态位，可在相对稳定安全的环境中生存[18-19]。植物与内生细菌可相互促进、相互依存，形成一种共生关系[20]。有些内生细菌具有抗菌、促生、与病原菌竞争生态位和营养物质、诱导植物产生抗性的作用[21-22]，可用于植物病害的生物防治。笔者根据内生细菌的特点和生防优势，从高抗白粉病的南瓜自交系22G3组织中分离获得29株菌株。其中，菌株B4-2对南瓜白粉病具有较高的拮抗活性，菌株B4-2发酵液处理白粉病菌孢子48 h后，其对孢子萌发抑制率为88.65%；发酵液处理发病的离体叶片和盆栽幼苗7 d后，其防治效果分别为79.58%和83.21%。表明菌株B4-2在南瓜白粉病的生物防治中具有一定的开发潜力。

笔者利用形态学和分子生物学技术，将对南瓜白粉病有较好防效的内生细菌B4-2鉴定为蜡样芽孢杆菌。前人研究表明，蜡样芽孢杆菌在水、土壤、植物、食品及饲料中广泛存在，且易于培养和保存。蜡样芽孢杆菌能抵抗电磁辐射、紫外线、高温、有害化学物质等，也能产生抗生素、抗菌肽、细菌素等多种抑菌活性物质[23-24]。目前，国内外在蜡样芽孢杆菌生防应用方面也有相关报道。朱海云等[25]从野生银杏中分离筛选出拮抗猕猴桃溃疡病的蜡样芽孢杆菌MA23，其发酵液对猕猴桃溃疡病的盆栽防治效果达93.6%。王刚等[26]研究表明，内生细菌蜡样芽孢杆菌B3-7可防治小麦全蚀病，其中B3-7的mota基因参与该菌株在小麦根系的内生定殖。从草莓组织中分离的蜡样芽孢杆菌菌株BCM2能长期定殖于番茄根部，能抑制番茄南方根结线虫的种群数量[27-28]。蜡样芽孢杆菌菌株YN917对水稻稻瘟病有一定的防治效果，防效达65.61%～68.51%[29]。笔者的研究虽然已从南瓜植株获得对白粉病有较好防效的蜡样芽孢杆菌B4-2，但对蜡样芽孢杆菌B4-2的生防机制、发酵工艺优化及生防产品的应用还需进一步研究。

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