红景天复合面膜的研制

为了研制具有多重皮肤生物活性的面膜，本研究将红景天提取物、牛油果树果脂、积雪草叶提取物、垂盆草提取物和透明质酸进行配伍，研制了红景天复合面膜。试验采用单因素方法确定油相和乳化剂的主要辅料组成和用量；同时，采用酪氨酸酶活性抑制试验、DPPH自由基清除试验以及面膜对小鼠皮肤中水分和胶原蛋白的影响试验评估了红景天面膜的生物活性。试验结果显示，所制备的面膜的各项检测指标均符合面膜的标准要求。此外，体外和小鼠试验也证实了面膜具有美白、抗氧化和抗皮肤衰老的三重生物活性。

关键词：红景天复合面膜；酪氨酸酶活性抑制；DPPH自由基清除；胶原蛋白

红景天为景天科植物大花红景天（Rhodiola crenulata （Hook. f. et Thoms.） H. Ohba）的干燥根和根茎，具有抗氧化和美白等护肤功效[1，2]。牛油果树果脂是从牛油果果实中提取的天然植物油脂，在临床上已经证实对皮肤具有保湿和改善皮肤干燥的活性[3]。伞形科植物积雪草（Centella asiatica （L.） Urb）的干燥全草，具有极高药用价值和较为广泛的药理活性，尤其在抗皮肤衰老、抗氧化，促进胶原蛋白合成方面[4-6]。垂盆草为景天科植物垂盆草（Sedum sarmentosum）的干燥全草。垂盆草中黄酮和三萜类成分通过与过氧化物结合，具有较强的抗氧化功效[7]。透明质酸具有良好的皮肤保湿效果，此外高分子透明质酸还具有控油功效，低分子透明质酸还具有促进皮肤成纤维细胞增殖作用[8，9]。

本研究以红景天提取物、牛油果树果脂、积雪草叶提取物、垂盆草提取物和透明质酸（高、低分子量）作为活性原料，制备具有美白、抗氧化和抗皮肤衰老三重复合功效的面膜。具体研究如下：（1）单因素确定面膜最佳制备处方组成；（2）体外和小鼠实验评估面膜的美白（抑制酪氨酸酶活性）、抗氧化（DPPH自由基清除）和抗皮肤衰老（增加皮肤水分和胶原蛋白含量）；通过本研究，为化妆品中面膜制备提供参考。

Part 1

仪器与材料

BSA323S （精度0.001 g）电子天平（德国赛多利斯公司）；PR224ZHE型（精度0.0001g）电子天平（沙鹰科学仪器有限公司）；TS800 酶标仪（美国安捷伦公司）；Ql-866型涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；KQ5200E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SiGmS高速冷冻离心机（北京五洲东方科技发展有限公司）；800D-1型离心机（常州天瑞仪器有限公司）；BIO-DL型移液枪（赛多利斯公司）；LHS-100F型恒温恒湿培养箱（上海精其仪器有限公司）；F6/10型电动均浆机（上海净信实业发展有限公司）；高速剪切机J200-SH（上海精其仪器有限公司）；台式面膜涂布机（苏州爱可姆机械有限公司）； 96孔酶标板（NEST biotechnology Co，Ltd.）。

红景天苷对照品（纯度：≥98%，上海诗丹德标准技术服务有限公司）；熊果苷（纯度：≥98%，上海诗丹德标准技术服务有限公司）；维生素C （纯度：≥98%，上海诗丹德标准技术服务有限公司）；海藻糖（Hayashibara Co.Ltd）；低聚果糖（山东白龙创园生物科技股份有限公司）；角鲨烷（Empresa Figueirense de Pesca，Lda）；聚甘油-2油酸酯和聚甘油-10油酸酯（The Nisshin Oillio Group，Ltd）；霍霍巴籽油（Vantage Speciallty Chemicals，Inc）；液体石蜡（山东利尔康消毒科技有限公司）；羟乙基脲（Nouryon Surface Chemistry AB）；甘油（P&G Chemicals Asia）；吐温-80 （南京威尔药业股份有限公司）；司盘-60 （天津致远化学试剂有限公司）；红景天提取物（云南英格生物技术有限公司）；牛油果树果脂（VantageSpeciallty Chemicals，Inc）；积雪草叶提取物（奇华顿日用香精香料（上海）有限公司）；垂盆草提取物（百朗德（广州）生物科技有限公司）；透明质酸钠（山东焦点福瑞达生物股份有限公司）、酪氨酸酶（美国Sigma公司）；L -酪氨酸上海麦克林生化科技有限公司）；DPPH （Shanghai Ruitai Biotechnology Co.， Ltd.）、D-半乳糖（美国Sigma公司）; 小鼠I型胶原蛋白ELISA kit （美国LSBio公司）;娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；PBS缓冲液、生理盐水（天津市化工三厂有限公司）；乙醇为分析纯（天津市化工三厂有限公司）。BALB/c Nude小鼠（SPF级，合格证号：2019-0010），并已通过伦理审批（伦理审批号BUCM-4-2019060515-1028）。

Part 2

试验方法

1.红景天面膜制备

将海藻糖（1.0%）、低聚果糖（0.5%）和甘油（4.0%）3种水相辅料和5种活性原料混合，再加纯净水溶解之后，使用高速剪切机剪切，得到所需的溶液A。按处方量将角鲨烷（0.2%）和霍霍巴籽油（0.5%）两种油相辅料和三种表面活性剂聚甘油-2油酸酯（0.1%）、聚甘油-10油酸酯（0.2%）和羟乙基脲（1.0%）混合，得到溶液B。将溶液B加入到溶液A中，高速剪切机剪切，再按处方补足纯净水，搅拌均匀，得到所需的溶液C。空白膜布快速通过低温区（-30℃），进行预冻。在预冻后的膜布上，涂布溶液C，涂布厚度为0.5 mm，上料质量25g/片。涂布之后再次通过低温冷冻，然后进行裁切成大小合适的片材，装入冻干机，真空度30 Pa，升华温度40℃，升华时间2h，即得初始配方的红景天复合面膜。

2.单因素试验

（1）油相霍霍巴籽油与液体石蜡对比

在多种油相配比中分别加入不同比例的霍霍巴籽油与液体石蜡，以此制备面膜样品。以感官属性、触感和黏度作为主要评价标准，分析两种油相添加剂对面膜性能的影响，并据此确定最终的油相配方成分。

（2）乳化剂配方组成

在不同乳化剂配方中分别加入不同用量的聚甘油-2油酸酯、聚甘油-10油酸酯、羟乙基脲组合与吐温80或司盘80，制备面膜。本实验以乳液的稳定性、面膜的黏度以及离心稳定性作为关键评估指标，分析不同乳化剂对面膜性能的影响。通过综合评价实验结果，以确定最适宜的乳化剂组成与用量。

（3）单因素考查辅料用量

实验设计6个配方，分别考查不同油相和乳化剂用量对面膜的影响，最终确定配方最优的辅料用量，不同配方设计见表1。

3.酪氨酸酶活性抑制试验

参考文献方法[10]，反应体系为pH6.5的PBS缓冲液。配制2.5kU·L-1 酪氨酸酶和45.0g·L-1 L -酪氨酸溶液。阳性对照为熊果苷溶液（1mg·mL-1）。将面膜中活性原料用PBS缓冲液超声溶解，按活性原料质量计算，母液浓度为2mg·mL-1。在96孔酶标板中加入供试样品溶液（供试品溶液+4 μL，酪氨酸酶+80μL，L-酪氨酸溶液）、阴性溶液（酪氨酸酶-L-酪氨酸溶液）和空白溶液（供试品溶液+ L-酪氨酸溶液）。整个反应体系为200μL，供试样品终浓度分别为1600μg·mL-1、800μg·mL-1、400μg·mL-1、200μg·mL-1、100μg·mL-1、50μg·mL-1，溶液不足200μL加PBS缓冲液补充。试验于37℃震摇3min，温孵20min，在492nm测吸光度（A）。以酪氨酸酶和L -酪氨酸生成黑色素量表示酪氨酸酶的活性。

以抑制率（%） = [（A阴性-A空白） - （A供试样品-A空白）/（A阴性-A空白）×100%计算供试样品对酪氨酸酶的抑制率。

4.抗氧化试验

抗氧化实验（DPPH自由基清除试验）主要参考相关的文献研究[11，12]。先精密称取DPPH，用无水乙醇溶解配置成50μg·mL-1溶液。阳性对照为维生素C溶液（浓度100μg·mL-1）。将面膜中活性原料用PBS缓冲液超声溶解，按活性原料质量计算，母液浓度为2mg·mL-1。在96孔酶标板中加入200μL供试品溶液（供试品溶液+ 100μL DPPH）、阴性溶液（100μL DPPH+100μL无水乙醇）和空白溶液（供试品溶液+100μL无水乙醇/纯净水）。整个反应体系为200μL，供试样品终浓度分别为1000μg·mL-1、500μg·mL-1、250μg·mL-1、125μg·mL-1、62.5μg·mL-1、31.3μg·mL-1，溶液不足200μL加纯净水补充。涡旋使样品混合均匀，再避光反应30min，517nm下吸光度（A），平行三次试验，按照如下公式计算供试品对DPPH自由基的清除率。

自由基清除率（%） = [1- （A供试样品- A空白）]/（A阴性- A空白）×100%。

5.对小鼠皮肤中水分和胶原蛋白的影响

参考文献方法[13，14]，动物分组与造模，雄性小鼠30只， 随机分成5组，每组6只，分别为正常对照组，模型组，阳性对照组，给药组。正常对照组小鼠背部每日贴敷空白面膜（不含活性原料的面膜基质成分，面积3×2cm2）20min。模型组，阳性对照组和给药组的小鼠在背颈部每日给予皮下注射10% D-半乳糖溶液1g·kg-1， 同时每天小鼠背部皮肤在波长400nm紫外光下照射40min，持续60天。从第10天开始，阳性对照组小鼠背部皮肤（面积3×2cm2）涂抹5%维生素E （VE）软膏，给药组小鼠背部每日分别贴敷面膜（面积3×2cm2）各20min。实验结束后处死小鼠。取小鼠背部面膜贴敷的皮肤组织，剪碎后置于组织匀浆器中，加入10倍量生理盐匀浆，使组织充分破碎。匀浆液5000r·min-1离心10min，离心后的上清液备用，按试剂盒说明书操作测定皮肤I型胶原蛋白含量。同时实验结束后取适量背部贴敷面膜的皮肤采用干燥法检测皮肤中含水量，参考文献方法[13]，按如下公式计算。

皮肤含水率/ % = （干燥前皮肤质量-干燥后皮肤质量） /干燥前皮肤质量×100计算皮肤含水率。

6.数据分析

单因素方差分析（Tukey-Kramer HSD检验）比较均值，以p＜0.05（*）或p＜0.01（**）表示差异有统计学意义。对酪氨酸酶的抑制和DPPH清除能力采用IC50评估，计算各个浓度供试样品的抑制活性和清除率，采用四参数Logistic拟合计算。

E=Emax+（Emin-Emax）/（1+EXP（a×（LogC-LogIC50）， Emax和Emin分别代表拟合最大和最小效应；C代表供试样品最终浓度；a代表拟合斜率），通过JMP软件（版本16.0.0）求解IC50。本研究中数据统计分析均由JMP 11.0.0平台实现（SAS Institute Inc.）。

Part 3

结果

1.单因素试验

配方单因素试验结果显示面膜的最佳配方组成为角鲨烷 0.2%、霍霍巴籽油2.0%、聚甘油-2油酸酯0.1%、聚甘油-10油酸酯0.2%、羟乙基脲5.0%和甘油2.0%，按此配方制备面膜检测结果如表2所示。

因此，可确定红景天复合面膜最终配方如表3所示。

2.体外功效试验

（1）酪氨酸酶抑制活性研究

由表4可知，在所测试的浓度范围之内，红景天面膜提取液对酪氨酸酶抑制率随浓度的增加而增加，在浓度为1600μg·mL-1时达到最大， 与对照组熊果苷相比无显著性差异（p>0.05），表明在此浓度下二者对酪氨酸酶抑制率基本相当。计算红景天面膜提取液对酪氨酸酶抑制的IC50值为218.8μg·mL-1。

（2） DPPH自由基清除研究

由表5可知，在所测试的浓度范围之内，红景天面膜提取液对DPPH的清除率随浓度的增加而增加，在浓度为500μg·mL-1时达到最大， 与对照组维生素C相比无显著性差异（p>0.05），表明二者对DPPH清除能力基本相当。计算红景天面膜提取液对DPPH的清除能力的IC50值为199.5μg·mL-1。

3.对小鼠皮肤的含水量和I型胶原蛋白含量影响

表6显示了红景天复合面膜对小鼠皮肤中含水量和胶原蛋白含量的影响。与正常对照组相比，模型组小鼠皮肤的含水量和胶原蛋白含量均显著下降（P<0.01）；与模型组相比较，VE组的皮肤含水量和胶原蛋白含量均显著升高（P<0.01），这说明模型建立成功。实验结果表明，红景天复合面膜能显著增加小鼠皮肤含水量（P<0.01）和胶原蛋白含量（P<0.05），面膜对衰老皮肤的改善效果与VE组类似。

Part 4

结论

本研究首次将多种对皮肤具有生物活性的可用于化妆品的原料进行配伍，研制了红景天复合面膜，并通过体外和小鼠实验对面膜的四种主要生物活性进行了评价。实验结果显示，红景天复合面膜表现出良好的美白效果（抑制酪氨酸酶活性）、抗氧化能力（DPPH自由基清除）以及抗皮肤衰老特性（增加皮肤水分和胶原蛋白含量）。此外，红景天复合面膜各项检测指标均符合QB/T2872—2007《中华人民共和国轻工行业标准》。本研究为其他面膜配方的研制和活性评价提供了可借鉴的思路和方法。

作者介绍

李和伟：博士，高级工程师，主要研究方向：化妆品和生物医药研究，供职于常州伟博海泰化妆品有限公司

代 颖，魏国志：供职于常州伟博海泰化妆品有限公司

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