温石棉对内皮细胞Wnt5a、p16和p21表达的影响
2024-07-13李莘李雪王谙
李莘 李雪 王谙
基金项目：天津市教委科研计划项目（2022YGYB14）
作者单位：1天津市海河医院病理科（邮编300350）；2天津市呼吸疾病研究所；3天津市海河医院基础医学实验部
作者简介：李莘（1980），女，主任医师，主要从事呼吸系统疾病的诊断及治疗方面研究。E-mail：x_li2012@hotmail.com
摘要：目的 探讨温石棉对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的影响。方法 实验组以50、100、200 mg/L温石棉纤维液刺激HUVECs 24、48、72 h，对照组仅加RPMI 1640培养基培养细胞，观察细胞形态变化，β-半乳糖苷酶法分析细胞衰老情况，四甲基偶氮唑蓝法检测细胞存活率。采用实时荧光定量PCR法检测细胞中Wnt5a、p16和p21 mRNA的表达情况。结果 实验组HUVECs多呈梭形，部分呈圆形或不规则形，出现裸核及空泡现象，可见死亡细胞。随温石棉质量浓度及暴露时间的增加，细胞活性逐渐降低，衰老细胞逐渐增多。100 mg/L温石棉处理HUVECs 24 h时，细胞生长较活跃。与对照组相比，实验组Wnt5a、p16和p21 mRNA表达水平均增高（P＜0.05）。结论 温石棉可促进HUVECs衰老，Wnt5a、p16和p21参与此过程。
关键词：石棉，蛇纹石；人脐静脉内皮细胞；肺纤维化；Wnt-5a蛋白；基因，p16；基因，p21
中图分类号：R563.9文献标志码：ADOI：10.11958/20240060
Effects of chrysotile on expression of Wnt5a， p16 and p21 in endothelial cells
LI Xin1， 2， LI Xue2， 3， WANG An2， 3
1 Department of Pathology， Tianjin Haihe Hospital， Tianjin 300350， China; 2 Tianjin Key Laboratory of Lung Regenerative Medicine; 3 Tianjin Institute of Respiratory Diseases， Tianjin Haihe Hospital
Abstract： Objective To investigate the influence of chrysotile on human umbilical vein endothelial cells （HUVECs）. Methods HUVECs in the experimental group were treated with 50， 100 and 200 mg/L chrysotile for 24， 48 and 72 h. The control group was cultured with RPMI 1640 medium only. Morphological changes of HUVECs were observed. Cell viability was detected by MTT assay. β-Galactosidase staining was used to analyze the cell senescence. The cell survival rate was determined by tetramethylazolium blue assay. Wnt5a， p16 and p21 expression were investigated by qRT-PCR. Results Cells of the experimental group were oval and irregular， and some of them were round or irregular， with naked nuclei and vacuolar， and dead cells were present. With the increase of chrysotile concentration and exposure time， the level of cell viability decreased and the number of aged cells increased gradually （P＜0.05）. The cell growth of HUVECs was more active when 100 mg/L chrysotile treated for 24 h. Compared with the control group， the mRNA expression levels of Wnt5a， p16 and p21 were increased in the experimental group （P＜0.05）. Conclusion Chrysotile can promote HUVECs senescence， and Wnt5a， p16 and p21 are involved in this mechanism.
Key words： asbestos， serpentine; human umbilical vein endothelial cells; pulmonary fibrosis; Wnt-5a protein; genes， p16; genes， p21
我国为全球第一石棉消费国，目前90%以上使用的是温石棉［1-2］。长期大量暴露于石棉会导致石棉肺、间皮瘤、肺癌、喉癌等疾病的发生［3-4］。根据矿物学及化学结构，石棉纤维分为蛇纹石（温石棉）和角闪石两大类，温石棉在细胞内不稳定，易裂解被吞噬［5］，长期高浓度吸入会出现石棉肺等表现。石棉肺是指吸入过量石棉纤维导致的弥漫性肺纤维化［6］，目前针对肺纤维化的治疗方法有限。衰老受损肺组织的病理表现包括成纤维细胞增生、细胞外基质（ECM）沉积、血管结构破坏。以往的研究主要集中在温石棉对肺泡上皮细胞及间皮细胞的作用，而对血管内皮细胞的研究不多。Wnt5a、p16和p21属于老化相关分子，其中Wnt5a还参与胚胎气道及血管的分化，而石棉肺的病理过程在一定程度上表现为老化及血管结构异常。本研究利用分子生物学方法检测了暴露在不同质量浓度温石棉下人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）Wnt5a、p16和p21表达情况，旨在探讨温石棉对内皮细胞分化、衰老过程的影响，为安全使用温石棉提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料 温石棉由西南科技大学环境与资源学院中心实验室惠赠。HUVECs购自北京北纳创联生物技术研究院，Trizol试剂、胎牛血清购自Invitrogen公司，RPMI 1640培养基、胰蛋白酶购自索莱宝公司，二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）细胞增殖检测试剂盒和细胞衰老特异性β-半乳糖苷酶检测试剂盒购自Sigma公司，Wnt5a、p16和p21引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司，SYBR Green实时荧光定量PCR（qRT-PCR）试剂盒购自罗氏公司。
1.2 温石棉悬液制备 将实验原矿反复碾压、劈分、剪短后进行细研磨，200目筛过滤，烘干，最后研磨成更细的粉体，高温充分杀菌消毒，加入RPMI 1640培养基制成200 mg/L粉尘悬液备用，实验时分别稀释为50 mg/L和100 mg/L。
1.3 细胞培养 取对数生长期的HUVECs，0.25%胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清1%双抗的RPMI 1640培养基制成细胞悬液，调整为2×105个/mL，接种到96孔细胞培养板中，每孔200 μL，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养72 h。
1.4 温石棉刺激实验及形态学观察 根据文献［7-8］，分别以50、100、200 mg/L温石棉纤维液1 mL处理细胞24、48、72 h。对照组仅加RPMI 1640培养基培养细胞。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。
1.5 β-半乳糖苷酶法观察细胞衰老情况 分别以50、100、200 mg/L温石棉纤维液1 mL处理细胞24、48、72 h后收集细胞，对照组为仅加RPMI 1640培养基培养的细胞。PBS清洗后固定液固定15 min，再次PBS清洗后，加入预热的37 ℃、1 mL β-半乳糖苷酶检测试剂盒中X-gal染色液，37 ℃孵育12 h，直至细胞出现蓝色，光学显微镜下观察，蓝色细胞为衰老细胞。每孔随机读取5个视野，计算衰老细胞占观察细胞总数的百分比。
1.6 MTT法检测细胞存活率 1.4实验结束后弃去上清液，加入5 g/L的MTT液20 μL，37 ℃避光培养4 h，空白对照组加入20 μL PBS。吸取孔内液体后，每孔加入DMSO 150 μL，震荡溶解15 min，酶标仪测定490 nm光密度（OD）值。计算细胞存活率（%）=（实验组OD/空白对照组OD）×100%。后续PCR实验选择细胞存活率较高的质量浓度和作用时间。
1.7 qRT-PCR检测细胞中Wnt5a、p16、p21 mRNA表达水平 100 mg/L温石棉处理24 h后收集细胞，Trizol法提取总RNA，反转录为cDNA。用SYBR One-step试剂盒进行qRT-PCR反应，引物序列见表1。反应体系（20 μL）：2×qRT-PCR缓冲液10 μL，酶混合液2.0 μL，ROX液0.4 μL，RNA模板2.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 4.8 μL。反应条件：50 ℃ 10 min；94 ℃预变性2 min；94 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，70 ℃延伸30 s，共35个循环。以β-actin为内参计算mRNA相对表达量。计算方式为2-ΔCt法计算，ΔCt=目的基因Ct-内参基因Ct。每组设立3个平行，实验独立重复3次。[基因名称 引物序列（5→3） 产物大小/bp Wnt5a 上游：CTAACTTAGCTGTGTGGGACATG 235 下游：AAATGCAGAAAGCAAGCTAGCAG p16 上游：CGGGGACATCAAGACATCGT 203 下游：GCCGGATTTAGCTCTGCTCT p21 上游：ACATCTCAGGGCCGAAAACG 173 下游：AAGACACACAGAGTGAGGGC β-actin 上游：CCACTGGCATCGTGATGGAC 171 下游：GCGGATGTCCACGTCACACT ][Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR
1.8 统计学方法 采用SPSS 29.0软件进行数据分析。计量资料以[[x] ±s
]表示，2组间比较采用t检验，多个时间点的比较采用重复测量资料的方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 细胞形态观察 见图1。实验组细胞多呈梭形，部分呈圆形或不规则形，出现裸核、胞核浓染及空泡现象，可见死亡细胞。随着时间的延长及温石棉质量浓度的增加，衰老及死亡细胞逐渐增多。对照组细胞呈长梭形，边界清楚，贴壁生长，胞质清亮，胞核清晰，细胞死亡不显著。
2.2 细胞衰老情况 随着刺激时间的延长及温石棉质量浓度的增加，实验组中蓝色衰老细胞数增加，见图2
2.3 细胞存活率变化 MTT实验发现，随温石棉质量浓度的增加及作用时间的延长，细胞存活率逐渐降低。处理24 h时，100 mg/L温石棉处理的细胞生长最为活跃（图3），以此质量浓度及时间作为后续PCR实验的依据。
2.4 细胞中Wnt5a、p16和p21 mRNA表达情况 与对照组相比，实验组Wnt5a、p16和p21 mRNA表达水平均增高（P＜0.05），见表3。
3 讨论
温石棉是一种硅酸镁盐，呈中空管状结构，易裂解并在细胞内沉积。石棉进入人体，产生的活性氧（ROS）使细胞DNA受损；同时石棉成分中的镁、硅等会破坏细胞稳态而致病［6］。这些机制决定了石棉相关疾病会具有较长潜伏期，时间跨度大，疾病个体差异大。动物实验发现，病变主要围绕小血管及支气管发生，出现炎症、轻度纤维化及闭塞性细支气管炎（BO）表现，表明温石棉会影响细支气管及其伴行血管的结构及功能，而血管结构异常会导致细胞缺氧及衰老，最终出现纤维化表现［9］。本研究中，实验组HUVECs在接受温石棉刺激后细胞形态出现不规则变化，可见死亡细胞。实验组β-半乳糖苷酶活性增加，衰老细胞数增多，均证实了温石棉对HUVECs存在一定的毒性作用。
本研究中低浓度温石棉刺激对细胞增殖有轻度促进作用，随接触时间延长及浓度的增加，毒性加大，细胞存活率快速下降，与以往研究结果相似［10］。由于温石棉产地不同，镁、硅含量不同，对于患者体内细胞的影响就更为复杂。
p16和p21是经典的细胞周期调控蛋白，能够使细胞周期停滞，在细胞衰老时表达增加［11-12］。本研究实验组中p16和p21高表达。有研究发现特发性肺纤维化（IPF）患者肺组织中p16表达明显升高，并且与IPF的病情严重程度呈正相关［13］。在小鼠肺纤维化模型中，靶向清除p16阳性细胞后，小鼠肺功能得到明显改善［14］。不同的是，在石棉处理过的人永生化支气管上皮细胞（BEP2D）中，p16表达无明显变化，p21表达下降［15］。这些结果的差异提示石棉在不同种类细胞中的作用可能有差异，这需要更深层次的探索。在温石棉中暴露1个月后，大鼠肺组织p16 mRNA水平升高，但在第6个月与第12个月时表达下降，表明温石棉不稳定的特性对于细胞的影响存在阶段性的差异［16］。温石棉通常含有硅、镁等成分，有的产地温石棉中还含有铁，这些成分在吸入的人体细胞中长期存在，影响细胞因子的合成。
Wnt5a属于Wnt/β-catenin信号通路，除影响胚胎气道和血管的分化外，还间接参与成人肺组织的损伤修复［17］。在肺纤维化模型中，博来霉素诱导产生的ROS损伤内皮细胞DNA后，细胞启动修复过程，激活Wnt/β-catenin等通路，Wnt5a表达增加［18］。敲除Wnt5a的小鼠胶原沉积减少，纤维化程度明显下降，IPF患者的支气管肺泡灌洗液中Wnt5a表达增加［19］。在温石棉刺激导致血管内皮细胞衰老的过程中，Wnt5a表达增高，提示Wnt5a参与血管内皮细胞受损的过程。Wnt5a、p16和p21同属细胞衰老相关基因，既往研究发现p21过表达会激活Wnt/β-catenin通路［20］，而Wnt5a是该通路的重要成员。温石棉诱导血管内皮细胞p21的过表达，与同时高表达的Wnt5a的关系还需要进一步研究。
综上所述，本研究发现暴露于温石棉后HUVECs衰老增多、活性下降，细胞中Wnt5a、p16和p21表达增加，提示在温石棉导致的血管内皮细胞老化过程中，Wnt5a、p16和p21参与了血管内皮细胞的损伤修复。
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（2024-01-10收稿 2024-03-03修回）
（本文编辑 魏杰）
