舍饲条件下藏仔猪腹泻源大肠杆菌毒力和粘附因子基因检测与耐药性分析

李龙 谭占坤 李文凤 刘锁珠

摘要：为有效预防和治疗藏仔猪腹泻，采用PCR和Kirby-Bauer纸片扩散法对西藏林芝市舍饲藏仔猪分离的102株腹泻源大肠杆菌（Escherichia coli）毒力基因、粘附因子基因和耐药性进行检测。大肠杆菌毒力基因和菌毛粘附因子基因检测结果表明，检出率最高的菌毛粘附因子基因是F18（45.10%），其次是F4（15.69%），所有菌株均未检出F41基因；102株菌株中有37株菌株未检出菌毛粘附因子基因。毒力基因中检出率最高的是Stx2e基因（25.49%），其次为STb：EAST-1基因（21.57%）和STa：STb基因（17.65%）。大肠杆菌菌毛粘附因子基因和非菌毛粘附因子基因检测结果表明，在检出AIDA-1基因的菌株中菌毛粘附因子基因（F18、F4）的菌株占比为44.73%，在检出paa基因的菌株中菌毛粘附因子基因（F18、F4）的菌株占比为54.17%；在检出eae基因的菌株中没有检测到F4基因。大肠杆菌对氯霉素、四环素、氨苄西林和链霉素表现出高的耐药性，对3种及以上抗生素产生耐药性的大肠杆菌菌株数占总菌株数的86.27%。

关键词：藏仔猪；腹泻源；大肠杆菌（Escherichia coli）；毒力基因；耐药性；菌毛粘附因子基因；非菌毛粘附因子基因

中图分类号：S828         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）06-0156-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.06.025 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Detection and drug resistance analysis of virulence and adhesion factor genes of

Escherichia coli from Tibetan piglets with diarrhea under house feeding conditions

LI Long1， TAN Zhan-kun2， LI Wen-feng1， LIU Suo-zhu2

（ 1. College of Animal Engineering， Yangling Vocational & Technical College， Yangling  712100， Shaanxi， China；2.College of Animal Science， Xizang Agricultural and Animal Husbandry University， Linzhi  860000， Tibet， China）

Abstract： To effectively prevent and treat diarrhea in Tibetan piglets， PCR and Kirby Bauer paper diffusion methods were used，the virulence genes， adhesion factor genes and drug resistance of 102 strains of Escherichia coli from Tibetan piglets with diarrhea in Linzhi， Xizang were detected. The detection results of virulence genes and pili adhesion factor genes in Escherichia coli showed that the pili adhesion factor gene with the highest detection rate was F18 （45.10%）， followed by F4 （15.69%）， and no F41 gene was detected in all strains； among the 102 strains， the pili adhesion factor gene was not detected in 37 strains. The gene with the highest detection rate among virulence genes was Stx2e （25.49%）， followed by the STb：EAST-1 gene （21.57%） and the STa：STb gene （17.65%）. The detection results of Escherichia coli pili adhesion factor genes and non pili adhesion factor genes showed that 44.73% of the strains containing AIDA-1 gene had pili adhesion factor genes （F18， F4）， and 54.17% of the strains containing paa gene had pili adhesion factor genes （F18， F4）；no F4 gene was detected in the strains that the eae gene was detected. Escherichia coli exhibited high drug resistance to chloramphenicol， tetracycline， ampicillin， and streptomycin， with 86.27% of the total bacterial strains exhibiting resistance to three or more antibiotics.

Key words： Tibetan piglets； diarrhea source； Escherichia coli； virulence genes；drug resistance； pili adhesion factor genes； non pili adhesion factor genes

致病性大肠杆菌（Escherichia coli）是引起仔猪腹泻的一种常见病原微生物，仔猪腹泻具有高发病率和死亡率的特点，给养猪业带来了巨大的经济损失。目前仔猪致病性大肠杆菌主要有产毒性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）、肠致病性大肠杆菌（Enteropathogenic Escherichia coli， EPEC）和Vero毒素大肠杆菌（Verotoxigenic Escherichia coli， VTEC）。不同类型致病性大肠杆菌的区分主要依据其所分泌的毒力基因和毒性机制，如ETEC分泌热不稳定性和热稳定毒素（Sta和Stb）、EPEC分泌紧密粘附素（Intimin）、VTEC分泌Vero毒素VT1和VT2［1］。

抗生素在养猪业中发挥预防和治疗疾病的重要作用，2020年前中国通过在饲料中添加抗生素类添加剂来保障猪的健康和促生产。长期低剂量在饲料中添加抗生素造成大量耐药菌产生和抗生素残留，严重危害到人类的公共安全和食品卫生，因此中国在2020年1月1日起全面禁止饲料中添加抗生素。

由于耐药菌的产生与扩散，许多国家已经开始对细菌耐药性展开监测，如丹麦、日本和加拿大等［2］。致病性大肠杆菌毒力基因和耐药基因更新频率会随着时间和地区的变化而改变［3］。因此对其毒力基因和耐药性的监测就显得尤为重要。致病性大肠杆菌引起藏仔猪流行性腹泻、黄痢、白痢和猪水肿病，其发病率和死亡率高，严重制约藏猪养殖业发展。西藏林芝市舍饲条件下藏猪源致病性大肠杆菌的优势血清型为O8、O64、O138、O107、O19、O125和O115等［3］，并且在西藏多个地区散养藏猪腹泻样品中检测出毒力基因［4，5］，但目前关于西藏林芝市舍饲条件下藏仔猪腹泻源大肠杆菌的毒力基因检测与耐药性分析还鲜见报道。本研究旨在调查西藏主要的藏猪饲养区林芝市舍饲条件下藏仔猪腹泻源大肠杆菌毒力基因检测和耐药性流行趋势，为该地区仔猪致病性大肠杆菌的防治和临床抗生素的合理利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株

2019年1月至2021年12月从西藏自治区林芝市藏猪养殖场无菌采集新鲜仔猪腹泻粪便，采集样品53份。新鲜粪样采用麦康凯培养基进行大肠杆菌初筛，分离纯化的菌株进一步通过16s rRNA序列分析鉴定为大肠杆菌，共分离大肠杆菌102株，分离菌株加入50%甘油后-80 ℃保存备用。

1.2 主要仪器与设备

麦康凯培养基、蛋白胨、酵母提取物等均购自陕西吉尔泰生物科技有限公司，细菌DNA提取试剂盒（OMEGA，D3350-01）购自山西诺其尔生物科技有限公司，引物合成和基因测序为南京金斯瑞生物科技有限公司。

C1000型PCR仪购自山西诺其尔生物科技有限公司，SNP-250型全自动生化培养箱购自上海精宏仪器设备有限公司，SW-CG-1FD型无菌操作台购自苏州安泰空气技术有限公司。

1.3 大肠杆菌毒力基因检测

以大肠杆菌DNA为模板进行毒力基因（LT、STa、STb、Stx2e和EAST-1）、菌毛粘附因子基因（F4、F5、F6、F18和F41）和非菌毛粘附因子基因（AIDA-1、paa、eae）的PCR扩增。参考文献［2，6，7］合成引物序列，具体序列信息如表1所示。PCR扩增反应体系（20 μL）：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，灭菌去离子水6 μL。扩增结束后，产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.4 大肠杆菌耐药性分析

利用Kirby-Bauer纸片扩散法对分离的大肠杆菌进行药敏试验，药敏试验结果判定参照美国临床和实验室标准协会推荐标准［8］，多黏菌素药敏试验结果判定参照欧洲抗菌药物敏感性实验指导委员会推荐标准［9］。当菌株有3种及以上抗生素超过推荐耐药标准时就认定为多重耐药菌［10］。

2 结果与分析

2.1 毒力基因与菌毛粘附因子基因检出率分析

大肠杆菌毒力基因和菌毛粘附因子基因检出结果如表2所示。检出率最高的菌毛粘附因子基因是F18（45.10%），其次是F4基因（15.69%）；只有2株菌株检出F5基因，1株菌株同时检出F18和F4基因，所有菌株均未检出F41基因；102株菌株中有37株菌株未检出菌毛粘附因子基因。毒力基因中检出率最高的是Stx2e基因（25.49%），其次为STb：EAST-1基因（21.57%）和STa：STb基因（17.65%）。

2.2 菌毛粘附因子基因和非菌毛粘附因子基因检出率分析

大肠杆菌菌毛粘附因子基因和非菌毛粘附因子基因检出结果如表3所示。在分离到的102株菌株中，38株检出AIDA-1基因，24株检出paa基因，只有1株检出eae基因。在检出AIDA-1基因的菌株中菌毛粘附因子基因（F18、F4）的菌株占比为44.73%，其中F18占比为42.10%，F4占比为2.63%；在检出paa基因的菌株中菌毛粘附因子基因（F18、F4）的菌株占比为54.17%；在检出eae基因的菌株中没有检测到F4基因。

2.3 耐药性分析

由表4可知，102株大肠杆菌对氯霉素、四环素、氨苄西林和链霉素的耐药率均大于80.0%，分别为88.2、86.3%、84.3%和80.4%。其次为庆大霉素、新霉素、头孢噻吩、多黏菌素和环丙沙星，分别为40.2%、35.3%、23.5%、22.5%和19.6%。对头孢唑啉、头孢吡肟、阿莫西林和恩诺沙星的耐药率均低于10.0%。

由表5可知，无耐药性的菌株占总菌株数的2.94%，对3种及以上抗生素产生耐药性的大肠杆菌菌株数占总菌株数的86.27%，其中3耐、4耐和5耐的菌株数较多，分别为31、26、24株，分别占总菌株数的30.39%、25.49%和23.53%。

3 讨论

大肠杆菌在不同地区和不同时期表现出不同的毒力类型［11］。本研究共分离102株藏仔猪腹泻源大肠杆菌，至少含有一种毒力基因的菌株高于毕斓婷等［12］和张敏等［13］分别在吉林省和四川省猪腹泻源大肠杆菌毒力基因的检出率。同时毕斓婷等［12］发现在吉林省猪场分离的腹泻源大肠杆菌毒力基因EAST-1的检出率最高（32%），本研究毒力基因中检出率最高的是Stx2e基因（25.49%），其次为STb：EAST-1基因（21.57%）和STa：STb基因（17.65%）。这可能与不同地区猪场所采取的免疫措施和生物安全手段不同有关。本研究发现含STb：EAST-1毒力基因同时不含菌毛粘附因子基因的菌株检出率最高，含有STb：EAST-1毒力基因的大肠杆菌致病性更强，更容易诱发仔猪腹泻［14］。

大肠杆菌菌毛粘附因子基因F18已被证实与水肿病密切相关，藏仔猪在感染致病性大肠杆菌时可能引起水肿病高发。不含菌毛粘附因子基因的大肠杆菌有37株，这可能与菌毛粘附因子抗原F4和F18的疫苗广泛使用有关，这类疫苗的广泛使用会引起大肠杆菌变异，产生新的未知菌毛粘附因子。

在对非菌毛粘附因子基因的检测中发现AIDA-1检出率高的菌株，F18的检出率同样很高。Niewerth等［15］的研究同样发现AIDA-1与F18之间存在很强的相关性，同时AIDA-1和F18增加人与猪之间交叉感染的风险。有报道显示paa与F4的关联性也很高［16］，与本研究结果相似。目前关于paa基因在致病性大肠杆菌中的作用还不是很清楚，但已有研究发现在含有paa基因的大肠杆菌中水平基因转移发生率显著提高［17］。eae基因在大肠杆菌对肠黏膜细胞粘附和入侵方面发挥重要作用，但在本研究中仅发现1株大肠杆菌含有eae基因。

耐药率检测结果显示，藏仔猪腹泻源大肠杆菌对氯霉素、四环素、氨苄西林和链霉素4种抗生素的耐药率均超过80.0%，对比杨海峰等［18］的研究结果。这可能是由于分离菌株的对象和地域差异造成的。对3种及以上抗生素产生耐药性的大肠杆菌菌株数占总菌株数的86.27%，其中3耐、4耐和5耐的菌株数较多，分别为31、26、24株，分别占总菌株数的30.39%、25.49%和23.53%。102株菌株中6耐及以上的菌株占比较低，与杨海峰等［18］和于吉锋等［19］的研究结论不一致，这可能与以下2个方面有关：一是西藏藏猪集约化养殖发展较慢，散养过程中无抗生素添加；二是中国2020年1月全面禁止饲料中添加抗生素，有效减缓细菌耐药性的产生。

4 小结

大肠杆菌毒力基因和菌毛粘附因子基因检出率表明，检出率最高的菌毛粘附因子基因是F18（45.10%），其次是F4基因（15.69%），所有菌株均未检出F41基因。毒力基因中检出率最高的是Stx2e基因（25.49%），其次为STb：EAST-1基因（21.57%）和STa：STb基因（17.65%）。在检出AIDA-1基因的菌株中菌毛粘附因子基因（F18、F4）的菌株占比为44.73%，在检出paa基因的菌株中菌毛粘附因子基因（F18、F4）的菌株占比为54.17%；在检出eae基因的菌株中没有检测到F4基因。大肠杆菌对氯霉素、四环素、氨苄西林和链霉素表现出高的耐药性；对3种及以上抗生素产生耐药性的大肠杆菌菌株数占总菌株数的86.27%。这些结果对藏仔猪大肠杆菌病的防治提供了理论依据。

参考文献：

［1］ VIDAL A， AGUIRRE L， SEMINATI C， et al. Antimicrobial resistance profiles and characterization of Escherichia coli strains from cases of neonatal diarrhea in Spanish pig farms［J］. Veterinary sciences， 2020， 7（2）：48.

［2］ DO K H， BYUN J W， LEE W K. Virulence genes and antimicrobial resistance of pathogenic Escherichia coli isolated from diarrheic weaned piglets in Korea［J］. Journal of animal science and technology， 2020， 62（4）：543-552.

［3］ DO K H， BYUN J W， LEE W K. Prevalence of O-serogroups， virulence genes， and F18 antigenic variants in Escherichia coli isolated from weaned piglets with diarrhea in Korea during 2008—2016［J］. Journal of veterinary science， 2019， 20（1）：43-50.

［4］ 刘鑫宇，张 辉，李 坤，等.西藏林芝地区仔猪白痢血清型及毒力基因检测［J］.中国兽医学报，2017，37（9）：1670-1675.

［5］ 王 刚，索朗斯珠，强巴央宗.西藏藏猪源大肠杆菌毒力基因检测与分型［J］.甘肃畜牧兽医，2017，47（6）：75-78.

［6］ BARANZONI G M， FRATAMICO P M， GANGIREDLA J， et al. Characterization shiga toxin subtypes and virulence genes in porcine shiga toxin-producing Escherichia coli［J］. Frontiers in microbiology， 2016（10）：574.

［7］ CHENG D， SUN H， XU J， et al. Prevalence of fimbial colonization factors F18ab and F18ac in Escherichia coli isolates from weaned piglets with edema and/or diarrhea in China［J］. Veterinary microbiology， 2005， 110（1-2）：35-39.

［8］ M100-S24，Performance standards for antimicrobial susceptibility testing； Twenty-fourth informational supplement［S］.

［9］ European committee on antimicrobial susceptibility testing. Breakpoint tables for 11 interpretation of MICs and zone diameters［S］.

［10］ MAGIORAKOS A P， SRINIVASAN A， CAREY R B， et al. Multidrug-resistant， extensively drug-resistant and pandrug-resistant bacteria： An international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance［J］. Clinical microbiology and infection， 2012， 18（3）：268-281.

［11］ DE LAGARDE M， VANIER G， DESMARAIS G， et al. A new multidrug-resistant enterotoxigenic Escherichia coli pulsed-field gel electrophoresis cluster associated with enrofloxacin non-susceptibility in diseased pigs［J］. Journal of applied microbiology， 2021， 130（3）：707-721.

［12］ 毕斓婷，冀亚路，袭恒豫，等.仔猪致泻性大肠杆菌毒力因子多重PCR检测方法的建立与应用［J］.中国兽医学报， 2022，       42（2）：1-6.

［13］ 张 敏，李旭廷，王 斌，等.四川地区猪源致病性大肠杆菌的分离鉴定与耐药性检测［J］.四川畜牧兽医，2018，45（10）：28-29，32.

［14］ NGELEKA M，PRITCHARD J，APPLEYARD G，et al. Isolation and association of Escherichia coli AIDA-I/STb， rather than EAST-1 pathotype， with diarrhea in piglets and antibiotic sensitivity of isolates［J］. Journal of veterinary diagnostic investigation， 2003， 15（3）：242-252.

［15］ NIEWERTH U， FREY A， VOSS T， et al. The AIDA autotransporter system is associated with F18 and stx2e in Escherichia coli isolates from pigs diagnosed with edema disease and postweaning diarrhea［J］. Clinical and diagnostic laboratory immunology， 2001， 8（1）：143-149.

［16］ ZHANG W， ZHAO M， RUESCH L， et al. Prevalence of virulence genes in Escherichia coli strains recently isolated from young pigs with diarrhea in the US［J］. Veterinary microbiology， 2007，      123（1-3）：145-152.

［17］ LECLERC S， BOERLIN P， GYLESYLES C， et al. Paa， originally identified in attaching and effacing Escherichia coli， is also associated with enterotoxigenic E. coli［J］. Research in microbiology， 2007， 158（1）：97-104.

［18］ 杨海峰，陈晓兰，吴 萌，等.仔猪腹泻源大肠杆菌耐药性调查及耐药基因检测［J］.畜牧与兽医，2019，51（5）： 66-69.

［19］ 于吉锋，康润敏，谢 晶，等.仔猪腹泻性大肠杆菌多黏菌素耐药基因mcr-1筛查及其多重耐药基因检测［J］.黑龙江畜牧兽医，2020（11）：86-91.