蜜环菌菌株DJ1的分子鉴定、生物学特性及人工培养

史雪叶，朱国胜，黄万兵，李裕荣，陈之林，付少彬

摘    要：为优化蜜环菌的人工培养条件，以蜜环菌菌株DJ1为研究对象，对其进行分子鉴定并通过生物学特性观察，筛选其最佳培养基和培养条件。结果表明，通过ITS序列构建的系统发育树可知，菌株DJ1属于高卢蜜环菌Armillaria gallica。DJ1生长的最优培养条件为PDA培养基+木屑100 g，麸皮5 g，水1 L，pH=6，培养温度23 ℃。出菇结果表明，在PDA+2%/4%/6%/8%玉米面培养基与木屑培养基中均可得到子实体，其中以添加4%玉米面的培养基出菇效果最好，出菇时间最快；随着玉米面添加量的增加，蜜环菌子实体的出菇率呈先上升后下降的变化趋势。研究结果可为蜜环菌的快速培育和人工驯化提供参考。

关键词：蜜环菌属；食药用菌；生物学特性；人工驯化

中图分类号：S646 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）06-079-09

Molecular identification， biological characteristics and artificial cultivation of Armillaria strain DJ1

SHI Xueye1， 2， ZHU Guosheng3， HUANG Wanbing3， LI Yurong2， CHEN Zhilin2， FU Shaobin1

（1. Department of Pharmacy， Zunyi Medical University， Zunyi 563000， Guizhou， China; 2. Horticultural Research Institute， Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang 550006， Guizhou， China; 3. Guizhou Institute of Crop Germplasm Resources， Guiyang 550006， Guizhou， China）

Abstract： To optimize the artificial culture conditions of Armillaria， using the Armillaria strain DJ1 as the research object， the author conducted molecular identification and biological characteristics observation to select the optimal medium and culture conditions. The results revealed that the phylogenetic tree constructed based on the ITS sequence indicated that the strain DJ1 belongs to Armillaria gallica. The optimal culture conditions for DJ1 growth were PDA medium with sawdust 100 g， bran 5 g， water 1 L， pH=6， and cultivation temperature of 23 °C. The results of mushroom emergence showed that fruiting bodies could be obtained in PDA + 2%/4%/6%/8% cornmeal medium and sawdust medium. Among them， the medium with 4% cornmeal had the best mushroom production effect and the fastest mushroom emergence time. With the increase of cornmeal addition， the mushroom yield of the fruiting bodies of Armillaria increased first and then decreased. The results of this study can provide a reference for the rapid cultivation and artificial domestication of Armillaria.

Key words： Armillaria; Edible and medicinal mushrooms; Biological characteristics; Artificial domestication

蜜环菌属真菌Armillaria （Fr.） Staude隶属担子菌亚门Basidiomycotina、伞菌目Agaricales、泡头菌科Physalacriaceae [1]，是中药材天麻与猪苓的必需共生菌[2-3]。此外，蜜环菌还可导致树木的局部腐朽，是多种林木的致病菌，严重者甚至使树木死亡[4-5]。蜜环菌子实体俗称榛蘑，广泛分布在温带到热带地区，味道鲜美，具有高蛋白、高粗纤维和低脂肪等特性[6-7]，是人们追求健康饮食的理想食品，经常食用可增强机体免疫力，被人们誉为“东北第四宝”。蜜环菌具有较高的药用价值，子实体、菌丝、菌索都可以入药，具有降血糖[8]、保护脑[9]、增强免疫[10]、抗菌消炎[11]、抗真菌[12]和抗病毒[13]等药理作用。

贵州省拥有丰富的食用真菌和药用真菌资源，野生食用菌种类在全国的80%以上，近年来贵州食用菌产业发展速度较快[14-16]，但部分大型真菌依旧没有实现人工培养的完全驯化。目前，榛蘑生产主要依靠林地自然发生和人工无序采摘的方式，野生榛蘑自然产量较低且无序采摘导致其野生资源减少，野生资源的供应又受到季节和地域的影响，使榛蘑价格居高不下[17]。近年来，国内外对蜜环菌的研究多集中在活性成分、药理作用及其产品开发等方面[18]，对子实体的驯化栽培只有零星报道。目前的栽培研究大多是仿野生或者在野生生境下播种，利用自然的温度、湿度等环境条件进行生长，但生产效益尚未达到理想水平，此项技术仍有待于深入研究[19-22]。蜜环菌的生长发育过程较复杂，子实体的形成需要低温、光照和湿度等环境因素协同作用[23-24]，目前尚未实现工厂化生产。为更有效地利用蜜环菌资源，提高其产量和品质，有必要加强对蜜环菌人工培养技术的研究，笔者通过对贵州地区一种蜜环菌属真菌进行生物学鉴定和培养条件的优化，旨在为蜜环菌的快速培育和开发利用提供关键的理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1    供试菌株    蜜环菌菌株DJ1由贵州省农作物品种资源研究所提供。

1.1.2    供试培养基和栽培培养基    供试培养基有6种，1号培养基：PDA培养基（土豆200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、水1 L，pH自然）；2号培养基：PDA培养基+木屑100 g，麸皮100 g，水1 L，pH自然；3号培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨6 g，玉米面30 g，琼脂15 g，水1 L[25]，pH自然；4号培养基：木屑100 g，麸皮100 g，葡萄糖20 g，牛肉膏5 g，琼脂15 g，水1 L[26]，pH自然。碳源培养基：2号培养基（不含葡萄糖）+4种碳源（葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、玉米面）20 g，pH=6。氮源培养基：2号培养基（不含麸皮）+4种氮源（牛肉膏、酵母粉、麸皮、蛋白胨）5 g，pH=6。

栽培培养基有2种，玉米面培养基：PDA培养基+0%/2%/4%/6%/8%/0%玉米面，水1 L；木屑培养基：木屑与玉米面质量比1∶0或1∶1，麸皮质量=蔗糖质量=1/10木屑质量，含水量65%左右。

1.2 方法

1.2.1    供试菌株系统发育树的绘制    供试菌株DNA基因的提取与扩增：供试菌株活化后，取出菌丝，清除培养基后，用液氮速冻，磨成粉状，DNA提取按照真菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行。采用真菌通用引物ITS1和ITS4（引物序列如表1）对菌株的内部转录间隔区进行PCR扩增，PCR反应体系共25 ?L，正反引物各1 μL，ddH2O为9.5 ?L。反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测后，将其扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

系统发育树的绘制：将测序序列在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.gov）数据库中进行在线BLAST分析。使用MEGA 11软件构建邻接树，建树时采用Maximum Composite Likelihood模型，经Bootstrap 1000次循环检验系统发育树的可靠性。

1.2.2    最优培养基的筛选    在1～4号培养基中分别接入菌株DJ1，每处理重复3次。接种后置于25 ℃培养箱暗培养，观察菌株在4种培养基上菌索的生长特性。

1.2.3    不同pH对菌株DJ1菌索生长的影响    使用1 mol·L-1 NaOH和1 mol·L-1 HCl分别调节2号培养基不同的pH梯度（5、6、7、8、9），采用平板培养法将1 cm3菌块接种于平板，每个处理设置3次重复，25 ℃培养箱暗培养，采用十字交叉法，自接种之日起定时划线测量（接种与测量方法下同）。

1.2.4    不同温度对菌株DJ1菌索生长的影响    调节2号培养基pH=6，接种菌株DJ1后分别置于不同温度（13、18、23、28、33 ℃）下进行培养，每个处理设置3次重复。

1.2.5    不同碳氮源配方对菌株DJ1菌索生长的影响    为继续优化菌株DJ1的最优培养基配方，分别设置在不同碳源、氮源的培养基上接种菌株DJ1，每个处理设置3次重复，调节pH=6，置于23 ℃培养箱暗培养，以不加碳源、氮源为对照。

以上试验均于2022年春夏两季在贵州省农业科学院园艺研究所实验室完成。

1.2.6    菌株DJ1子实体的驯化栽培    试验于2022年8月在贵州省农业科学院园艺研究所实验室进行，将玉米面培养基分别装入三角瓶（250 mL）中，装量150 mL，高压灭菌30 min，冷却后接种菌株DJ1，每处理3次重复，培养箱暗培养25～30 d，然后转入白天温度22 ℃、晚上温度16 ℃、12 h散射光环境中培养出菇。

将木屑栽培料装入培养瓶（850 mL聚乙烯瓶），装量1/2，高压灭菌35 min，冷却后接种菌株DJ1，每处理3次重复，培养箱暗培养30 d至菌丝长满培养瓶，继续培养15 d，待菌丝充分后熟后，转入白天温度22 ℃，晚上温度16 ℃，12 h散射光环境中培养出菇。

1.3 数据处理

采用Microsoft Office Excel 2007软件统计分析数据，采用SPSS 25.0 软件对数据进行差异显著性分析，采用Adobe Photoshop 2021软件对图片进行处理。

2 结果与分析

2.1 供试菌株的系统发育分析

基于rDNA-ITS序列构建的系统发育树如图1所示，菌株DJ1与参考序列OL411636 Armillaria gallica聚为1支，相似度为99%，覆盖率100%。

2.2 最优培养基的筛选

通过观察记录菌株DJ1在4种培养基上的生物学特性，发现其生长的最优培养基为2号培养基，在此培养基上菌株DJ1菌索长势良好、粗壮，菌索萌动早，且长满培养基时间短（表2、图2）。

2.3 不同pH对菌株DJ1菌索生长的影响

由表3、图3可知，菌株DJ1在pH=5～9处理下均生长良好，各处理组的菌索生长量与粗细程度均无显著差异，其中以pH=6菌索生长最快且最粗壮。

2.4 不同温度对菌株DJ1菌索生长的影响

由表4、图4可知，菌株DJ1在不同温度培养条件下的生长状况有较大差异，在33 ℃高温培养下仅见少量白色菌丝萌发，后停止生长；在13～28 ℃培养条件下均可生长，其中在23 ℃培养下长势最好，生长量最大，当温度低于18 ℃或高于28 ℃时菌索生长速度缓慢。

2.5 不同碳氮源配方对菌株DJ1菌索生长的影响

由表5、图5、图6可知，菌株DJ1在对碳源的利用中，加入葡萄糖、蔗糖和麦芽糖与不加碳源（CK）相比，均提高了菌索生长量，但差异不显著，菌索粗壮程度均优于CK，其中以对葡萄糖的利用最佳，而菌株DJ1对玉米面的利用最差，菌索生长量和菌索粗壮程度均低于CK。在对氮源的利用中，菌株DJ1对4种氮源的利用与不加氮源（CK）相比，菌索生长量和粗壮程度均无显著差异，其中以对麸皮的利用最佳。

综上所述，菌株DJ1经优化后的培养条件为：PDA培养基+木屑100 g，麸皮5 g，水1 L，pH=6，温度23 ℃。

2.6 菌株DJ1的驯化培养及生长各时期的形态观察

由表6、图7可知，在不添加玉米面的2种栽培培养基中未见原基及子实体形成，而添加一定量玉米面的培养基经过温差和光照等刺激后，一些菌落开始向子实体原基分化，在2种栽培培养基表面均可以观察到其表层有很多气生菌丝，但只有小部分气生菌丝可以扭结形成原基，大部分菌落只停留在菌落堆状态，没有再进一步分化为原基。其中在玉米面培养基中，菌株DJ1在PDA+0%、2%、4%、6%、8%、10%玉米面含量下的菌索生长量无显著差异，以在PDA+4%玉米面培养基中生长最快。除未添加玉米面的培养基与添加10%玉米面的培养基未出菇外，添加2%、4%、6%、8%玉米面的培养基均有子实体出现，以添加4%玉米面的培养基出菇效果最好，出菇最快，其次是添加2%玉米面培养基。该结果表明，随着玉米面添加量的增加，出菇率呈现先上升后下降的变化趋势。

菌株DJ1在固体培养基中接种后2～3 d菌丝萌发，乳白色，然后分化形成菌索（图8-A），菌索能够从为其提供营养物质的基物中伸出，进入另一个并不支持其生长的基物中[27]，在这个过程中，菌索顶端二叉分支或不分支，幼嫩菌索淡黄色或乳白色（图8-B～C），伴随着生长，不断分支（图8-D）。菌索由致密的红褐色至黑褐色的外壳层和白色菌丝构成的髓心组成（图8-E），随着菌索长满培养基（以木屑培养基为例），菌索会在培养基表层形成一层黑色脆弱的盘（图8-F），充分后熟后，经过温度、光照等环境因素的刺激，开始形成原基（图8-G），给予合适的环境条件，逐渐生长为菇蕾（图8-H）、幼菇（图8-I）及成熟子实体（图8-J）。

3 讨论与结论

珍贵中药材天麻与猪苓生长的优劣与其必需共生菌蜜环菌的菌索特征，如粗细、分支和颜色等有关[28]，子实体的形成也与菌索的生长密切相关[29]，好的蜜环菌菌种除与菌株本身的遗传特性有关外，还依赖于培养环境和培养基质所提供的养分，只有在比较充足的营养环境下，生理功能才能正常完成，性状才能得以稳定的表达[30]。孙小卫等[31]对野生和人工培养的蜜环菌菌索主要营养成分进行测定，发现人工培养菌索的蛋白质、氨基酸、脂肪、多糖含量均高于野生菌索，认为人工培养的蜜环菌菌索可代替野生菌索应用在食品和医药保健品中。

国内外对蜜环菌子实体生长的研究表明，子实体形成对培养基有一定的要求，不同蜜环菌对培养基质的适应性不同，开发挖掘适合不同蜜环菌生长发育的基质非常必要。不少学者对蜜环菌的栽培基质进行摸索[32-37]，成功驯化出了蜜环菌子实体。目前蜜环菌子实体已经在合成培养基中培养成功，如麦芽汁培养基[23-24]和10%玉米面培养基[38]等。在本研究中，菌株DJ1在4种培养基上的生长状态不同，在2号培养基上生长情况最优，菌索粗壮，分布稠密，在4号培养基上生长情况较差。菌株DJ1最优碳氮源分别为葡萄糖和麸皮，但当氮源含量固定时，不同氮源种类（指本试验所用的4种氮源）与CK相比，对DJ1菌索生长量与粗壮程度的影响均无显著差异，因此在蜜环菌菌丝体生产实践中尤其要重视碳源种类的筛选。

笔者首次在PDA+玉米面培养基上成功培育出蜜环菌子实体，除PDA培养基与添加10%玉米面培养基上未见子实体外，添加2%、4%、6%、8%玉米面的培养基均可培育出子实体。其中，不同玉米面含量的6种培养基菌索生长量无显著差异，但添加4%玉米面的PDA培养基菌索长势最好，且出菇时间最短，出菇效果最好。笔者推测添加一定量的玉米面不仅可以为蜜环菌菌丝的生长提供较多且易于利用的营养和能量，还可以促进其从营养生长到生殖生长的转换，形成子实体，该结论与于海龙等[39]和马丽峰等[40]的研究结果一致。其次，笔者采用木屑与玉米面质量比1∶1，麸皮质量=蔗糖质量=1/10的木屑质量培养基在培养瓶中成功驯化出菌株DJ1子实体。

综上所述，菌株DJ1属于高卢蜜环菌Armillaria gallica。菌株DJ1最优培养条件为PDA培养基+木屑100 g，麸皮5 g，pH=6，温度23 ℃，在此条件下，菌丝洁白，菌索生长良好。在PDA+玉米面培养基上成功培育出蜜环菌子实体，其中以添加4%玉米面的PDA培养基菌索长势最好，出菇时间最短，出菇效果最好。笔者优化了菌株DJ1的培养条件，可为实现蜜环菌的快速培育提供参考。蜜环菌的药用和食用部分多为子实体，笔者提供了蜜环菌出菇的两种栽培培养基并探索了玉米面添加量与出菇率的关系，有望对蜜环菌的人工栽培及开发利用提供指导与帮助。

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