超声辅助酶法制备富锌低分子牡蛎肽的工艺研究

李佳蔚 曾珊 杨君扬 陈忠琴 谭明堂 高加龙 郑惠娜 苏伟艺 曹文红

摘要：以香港牡蛎为原料，通过酶解法制备富锌牡蛎酶解产物并对其相对分子量图谱和氨基酸组成进行分析。经过蛋白酶筛选、超声预处理后应用单因素试验、正交试验以及时间曲线优化酶解工艺，提高酶解产物的水解度和生物锌释放量。采用超声功率500 W、超声时间10 min进行预处理，选择动物蛋白酶进行酶解。最佳酶解工艺为加酶量1.6%、酶解时间4 h、酶解温度50 ℃、料液比1∶4、pH 6.5，得到牡蛎酶解产物水解度为49.581%。酶解产物的锌含量（以干基计）为680.831 mg/kg。牡蛎肽相对分子量小于1 000 Da的组分达到81.87%，富含酸性氨基酸谷氨酸和天冬氨酸。香港牡蛎酶解产物中含有丰富的小分子肽，氨基酸组成较完善，锌含量较高，可为后续富锌产品的开发奠定基础。

关键词：香港牡蛎；富锌；牡蛎肽；超声辅助酶解；低分子量

中图分类号：TS254.1

文献标志码：A

文章编号：1000-9973（2024）06-0108-07

Study on Preparation Process of Zinc-Rich Oyster Peptides with Low Molecular

Weight by Ultrasound-Assisted Enzymatic Hydrolysis Method

LI Jia-wei¹， ZENG Shan¹， YANG Jun-yang¹， CHEN Zhong-qin^1，2， TAN Ming-tang^1，2， GAO Jia-long^1，2，

ZHENG Hui-na^1，2， SU Wei-yi³， CAO Wen-hong^1，2*

（1.College of Food Science and Technology， Guangdong Ocean University， Zhanjiang 524088， China; 2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety， National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing Technology， Zhanjiang 524088， China; 3.Market Supervision Licensing Technology Review Center in Shunde District， Foshan City， Guangdong Province， Foshan 528399， China）

Abstract： With Crassostrea hongkongensis as the raw material， the zinc-rich oyster enzymatic hydrolysate is prepared by enzymatic hydrolysis method， and its relative molecular weight chromatogram and amino acid composition are analyzed. Through protease screening and ultrasound pretreatment， single factor test， orthogonal test and time curves are used to optimize the enzymatic hydrolysis process， so as to improve the hydrolysis degree of enzymatic hydrolysate and the release amount of biological zinc. Using ultrasonic power of 500 W and ultrasonic time of 10 min for pretreatment， animal protease is selected for enzymatic hydrolysis. The optimal enzymatic hydrolysis process is as follows： the enzyme addition amount is 1.6%， enzymatic hydrolysis time is 4 h， enzymatic hydrolysis temperature is 50 ℃， solid-liquid ratio is 1∶4 and pH is 6.5. The hydrolysis degree of the obtained oyster enzymatic hydrolysate is 49.581%. The zinc content of the enzymatic hydrolysate （on dry basis） is 680.831 mg/kg. The components of oyster peptides with relative molecular weight less than 1 000 Da reach 81.87%， which are rich in acid amino acids， namely glutamic acid and aspartic acid. The enzymatic hydrolysate of Crassostrea hongkongensis contains abundant small-molecular peptides， with a relatively complete amino acid composition and high zinc content， which can lay a foundation for the development of zinc-rich products in the future.

Key words： Crassostrea hongkongensis; zinc-rich; oyster peptide; ultrasound-assisted enzymatic hydrolysis; low molecular weight

收稿日期：2023-12-07

基金项目：湛江市科技计划项目（2022A05038）；国家重点研发计划（2018YFD0901105）；贝类产业技术体系（CARS-49）

作者简介：李佳蔚（1995—），女，硕士，研究方向：食品加工与安全。

*通信作者：曹文红（1977—），男，教授，博士，研究方向：海洋食品营养与功能。

锌是人体必需的一种微量元素，对维持机体生理功能和正常代谢起着重要作用^[1-2]。由于人体内不能储存锌元素，所以需要通过食物进行补充来维持体内环境的稳定^[3]。近年来调查发现，我国膳食结构中锌补充严重不足，特别是儿童和老人^[4]。缺锌会引发健康问题，比如影响生长发育、味觉和嗅觉障碍以及免疫缺陷等^[5-6]。如何高效、安全且方便地为人体补充锌是如今食品领域的研究重点。传统的补锌剂与人体发生不利反应，会使生物利用率下降，导致吸收效率低^[7]，因此将具有溶解性强、生物利用率高、毒副作用小等优点的生物锌作为锌元素的补充，更有利于锌元素的消化吸收。

超声波是一种新兴的绿色加工技术，应用于各种食品加工过程中^[8]。诸多研究表明超声波可以增强分子运动速度和频率，破坏组织细胞壁，释放细胞中物质^[9]，同时可以软化蛋白质的结构，从而达到提高酶解效率的目的^[10]。研究表明酶解得到的低分子肽吸收速度快，需要能量低，因此更容易被机体吸收利用^[11]。

香港牡蛎（Crassostrea hongkongensis）主要分布在广东、广西等地区，而湛江香港牡蛎年产量约40万吨，占全国的10%。牡蛎中的锌含量较高，课题组前期研究表明，香港牡蛎的锌浓度为126.751 mg/kg，是补锌的良好来源^[12]。根据食品安全国家标准GB 28050—2011的要求，富锌食品的标准为≥45 mg/kg。目前市面上富锌产品大多为螯合金属产物，通过对原料进行富集处理以达到安全性更高的补锌产品很少，因此本研究通过超声预处理和酶解明确富集制备富锌低分子牡蛎肽的最佳工艺，为之后富锌产品的研发奠定基础，对牡蛎精深加工的多样性具有一定意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香港牡蛎：2022年9月购于霞山水产品批发市场，洗净沥干，分装，于－20 ℃冷冻贮藏；动物蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、Protamex 1.6：南宁庞博生物工程有限公司；浓硝酸（分析纯）、浓硝酸（优级纯）：广州化学试剂厂；氢氧化钠标准溶液（分析纯）：罗恩试剂；甲醛（分析纯）：广东光华科技股份有限公司；邻苯二甲醛（分析纯）、17种氨基酸混合标准品：美国Sigma公司；PEG：Polymer Standards Service GmbH（PSS）公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯）：CNW Technologies GmbH公司。

1.2 主要仪器与设备

Thermo LYNX6000高速落地离心机 美国Thermo Fisher Scientific公司；2-16KL台式高速冷冻离心机 美国Sigma公司；SHJ-AB磁力搅拌水浴锅 常州金坛良友仪器有限公司；Anton Paar Multiwave Pro41微波消解仪 奥地利安东帕公司；FB224电子分析天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；LGJ-18冷冻干燥机 河南兄弟仪器设备有限公司；Eyela旋转蒸发仪 东京理化器械株式会社；Agilent 1260高效液相色谱仪、Agilent 1100液相色谱仪 安捷伦科技（中国）有限公司；KQ-500DE超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；TAS-990AFG原子吸收分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 试验方法

1.3.1 香港牡蛎酶解产物的制备

将香港牡蛎肉置于4 ℃冰箱中冷藏解冻后用料理机打成肉糜状，称取15.00 g牡蛎肉糜置于烧杯中，再加入一定比例的超纯水，使用均质机均质（10 000 r/min，60 s），超声处理10 min后用1 mol/L NaOH调节蛋白酶解所需pH，加入适量的蛋白酶混匀后在磁力搅拌水浴锅中设置温度酶解一定时间，酶解过程中维持pH稳定；酶解结束后，在100 ℃下灭酶20 min，混合液于4 ℃离心（9 000 r/min，15 min），取上清液备用。

1.3.2 蛋白酶的筛选

结合课题组前期研究^[13]，选择动物蛋白酶（最适pH 6.5）、中性蛋白酶（最适pH 7.0）、菠萝蛋白酶（最适pH 7.0）、木瓜蛋白酶（最适pH 6.5）和Protamex 1.6（最适pH 7.0）5种蛋白酶分别按照1.3.1的步骤对牡蛎肉进行酶解处理，选择料液比1∶3、加酶量1.6%、时间3 h、温度50 ℃，同时调节pH为各蛋白酶的最适pH，以水解度（degree of hydrolysis，DH）为指标，选出最优蛋白酶。

1.3.3 水解度的计算

参考王仁佳等^[14]的方法，采用甲醛滴定法测定水解度。水解度（DH）计算公式见公式（1）：

DH=A－BC－D×100%。（1）

式中：DH为水解度，%；A为酶解液中氨基氮含量，g/100 g；B为原料中游离氨基氮含量，g/100 g；C为原料中总氮含量，g/100 g；D为原料中非蛋白氮含量，g/100 g。

1.3.4 超声预处理

分别采用150，300，400，500，600 W 5种不同功率对均质后的牡蛎浆液超声10 min，以蛋白水解度为指标，选择最优的超声功率。

1.3.5 单因素试验

选择不同的酶解温度、pH、料液比、加酶量4个因素进行单因素试验，以水解度为指标，探究各个单因素对香港牡蛎肉水解度的影响。设置酶解温度分别为45，50，55，60，65 ℃，pH分别为6，6.5，7，7.5，8，料液比分别为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，加酶量分别为0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%，控制酶解时间为3 h，进行初步优化。

1.3.6 正交试验优化香港牡蛎酶解工艺

在单因素试验的基础上，确定酶解温度、pH、料液比、加酶量4个因素进行L₉（3⁴）正交试验设计，见表1。以香港牡蛎蛋白水解度为指标，确定最优工艺条件。

1.3.7 酶解时间对香港牡蛎水解度和锌释放量的影响

在工艺优化基础上得到的最优条件下，对比不同酶解时间对锌释放量和蛋白水解度的影响，酶解时间设置为0.5，1，1.5，2，3，4，5 h。

1.3.8 锌释放量的计算

锌释放量计算公式见公式（2）：

X=A×VM×m×100%。（2）

式中：X为锌释放量，%；A为酶解液中锌含量，mg/L；V为酶解液总体积，L；M为香港牡蛎肉中总锌含量，mg/kg；m为样品质量，g。

酶解液中锌含量的测定参考GB 5009.14—2017中的方法。

1.3.9 超滤分离

利用0.45μm水相滤膜抽滤除去大分子物质、杂质等，选择3，5，8，10 kDa 4个超滤膜板对抽滤后的滤液进行超滤分级，得到＞10 kDa、8～10 kDa、5～8 kDa、3～5 kDa、＜3 kDa 5种超滤组分。

1.3.10 分子量分布测定

采用凝胶渗透色谱法（gel permeation chromatography，GPC）测定香港牡蛎酶解产物的分子量分布。色谱条件：色谱柱：Waters Ultrahydrogel 500-250-120A（300 mm×7.8 mm）；流动相：0.1 mol/L NaNO₃水溶液；流速：1 mL/min；柱温：40 ℃；进样体积：40μL。标准品为聚乙二醇（PEG）。以保留时间（t）和分子量的对数lgM回归，得到分子量回归方程：lgM=16.91－0.941 2t+0.016 7t²－0.000 113 6t³（R²=0.999 7）。

1.3.11 氨基酸组成分析

根据GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》测定氨基酸含量，采用全自动氨基酸分析仪对牡蛎酶解产物及超滤组分的氨基酸组成进行分析。

1.3.12 锌含量的测定

根据GB 5009.14—2017，采用微波消解和火焰原子吸收光谱法测定样品中的锌含量。

1.4 数据处理

以上试验均重复3次，采用Excel 2021、IBM SPSS Statistics 27.0.1进行数据处理和方差分析，P＜0.05表示差异显著且具有统计学意义，采用Origin 2021作图。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的筛选

在水产品酶解过程中，蛋白酶的选择尤为重要，中性蛋白酶应用于鱿鱼皮胶原蛋白肽的制备^[15]，动物蛋白酶在鱿鱼内脏中酶解制备水产品调味基料中的应用研究^[16]，菠萝蛋白酶应用于ACE抑制肽活性作用机制的研究^[17]，木瓜蛋白酶在制备抗氧化活性壳寡糖中的应用研究^[18]，Protamex 1.6复合蛋白酶在牡蛎风味物质^[19]以及水解蛋白中有较多的研究。诸多的研究结果表明，蛋白酶在水产品水解中起到重要的作用，并且能力显著，因此选择以上5种蛋白酶对牡蛎进行酶解。蛋白酶对香港牡蛎蛋白水解度的影响见图1。

由图1可知，在香港牡蛎蛋白酶解中，木瓜蛋白酶等4种蛋白酶的水解度均低于35%，动物蛋白酶的水解度达到42.69%，显著高于其他蛋白酶（P＜0.05）。因此，在后续试验中选择动物蛋白酶。

2.2 超声预处理功率的选择

赵钰等^[20]利用超声辅助酶解草鱼鳞，制备的胶原蛋白肽得率显著提高。较多研究表明超声可提高蛋白水解度，如Lan等^[21]利用超声辅助酶解猪皮蛋白，其水解度提高了50%。超声功率对水解度的影响见图2。

由图2可知，随着超声功率的增大，水解度逐渐上升，在超声功率为500 W时达到最高，为47.63%，显著高于其余超声功率处理的组别（P＜0.05），与超声处理前相比水解度提高了4.94%，可能是因为超声处理的过程中会使得亲水性基团暴露，有利于底物和酶进行结合，提高酶解效率；超声功率继续上升，水解度反而下降，可能是因为蛋白质分子构象被破坏，使得酶活力下降，从而导致水解度下降，与蓝尉冰等^[22]的研究结果一致。

2.3 动物蛋白酶酶解单因素试验结果

2.3.1 温度对香港牡蛎肉水解度的影响

由图3可知，随着温度的上升，水解度整体呈现先上升后下降的趋势，在50 ℃时水解度达到最大值，为 47.63%，55～65 ℃之间水解度大幅度降低，不同温度之间差异均显著（P＜0.05）。动物蛋白酶最适的反应温度在50 ℃左右，温度过高或者过低都会对水解能力产生影响。在最适温度下，随着温度不断上升，酶活性也不断上升，因此水解度逐渐上升；当超过动物蛋白酶最适温度时，酶解效率出现下降趋势，这是因为在此过程中有部分酶失活，导致水解度逐渐下降^[23]。因此，选择45，50，55 ℃进行后续正交试验。

2.3.2 pH对香港牡蛎肉水解度的影响

由图4可知，随着pH的增加，水解度整体呈现先上升后下降的趋势。在pH为6.5时水解度最大，为47.63%，显著高于其他组别（P＜0.05），这可能是因为pH会影响底物中的羧基、氨基等基团的状态，进而影响蛋白酶与底物的催化，使得其结合减少，水解度下降^[24]。因此，选择pH 6.0，6.5，7.0进行后续正交试验。

2.3.3 加酶量对香港牡蛎肉水解度的影响

由图5可知，当加酶量在0.8%～1.6%之间时，水解度呈上升趋势，在1.6%时达到最大，为47.63%。加酶量超过1.6%后，水解度下降。随着酶添加量的继续增加，水解度的变化不显著（P>0.05）。随着蛋白酶添加量的增加，底物与酶的接触增大，因此水解度上升较快；但酶的添加量达到一定量时，随着底物逐渐减少，酶解产物增多，可能达到饱和的状态，因此水解度在后期波动不大，这与黄艳燕等^[25]和肖雪等^[26]的研究结果一致。因此，选择加酶量1.4%、1.6%、1.8%进行后续正交试验。

2.3.4 料液比对香港牡蛎肉水解度的影响

由图6可知，料液比为1∶1时水解度最低，仅为35.86%，此时酶解样品较浓稠，牡蛎肉糜分散能力弱，与酶的接触受此影响从而使得水解度较低；料液比为1∶3时水解度最高，为47.63%，显著高于1∶2时的水解度（P＜0.05），可能是因为体系内流动性合适，有利于反应的进行^[27]；之后随着料液比的增大，溶剂体积增大，导致酶与底物的接触点减少，因此水解度呈现下降趋势^[28]。因此，选择料液比1∶2、1∶3、1∶4进行后续正交试验。

2.4 香港牡蛎超声辅助酶解工艺正交优化

由表2可知，各因素对香港牡蛎水解能力影响的主次顺序为C＞A＞D＞B，即料液比＞酶解温度＞加酶量＞pH，得到的最优试验方案为A₂B₂C₃D₂，即料液比1∶4、酶解温度50 ℃、加酶量1.6%、pH 6.5，此条件下水解度为49.581%。

2.5 酶解时间对水解度和锌释放量的影响

采用正交试验的优化结果为条件，探究不同酶解时间对水解度和锌释放量的影响，结果见图7。

由图7可知，锌释放量与水解度呈现一定的相关性，在一定酶解时间内，锌释放量随着水解度的增大而增加。当酶解时间为0.5～3 h时，水解度增长迅速，3 h时达到最高，此时水解度为49.581%，3 h后水解度基本趋于稳定；锌释放量在4 h时迅速达到最高，为77.90%，高于其他时间的锌释放量，可能是因为在此过程中底物逐渐被酶解，各类蛋白在不同时间段被分解，释放出含锌的肽，因此使得锌释放量增大。继续酶解，水解度无变化，锌释放量有所降低。

2.6 香港牡蛎酶解产物相对分子量分布分析

采用水相GPC测定香港牡蛎酶解产物相对分子量分布，分子量分布图谱见图8。

由表3和图8可知，牡蛎酶解产物主要由小分子肽段构成。相对分子量小于1 000 Da的组分占81.87%，其中500～1 000 Da的组分占13.67%，200～500 Da的组分占68.20%。有研究表明，小肽的吸收效率高，更容易被吸收利用，从而能更好地发挥多种功能活性^[29]。

2.7 香港牡蛎酶解产物及不同超滤组分中氨基酸组成分析

由表4可知，香港牡蛎酶解产物总氨基酸含量达499.033 mg/g，参与金属离子配位较高的是Glu、Asp、His等^[30]，酸性和碱性氨基酸残基与锌的螯合也有较重要的作用，酶解产物中Glu和Asp的含量较高^[31]，Glu含量达到65.891 mg/g，Asp含量达到48.512 mg/g。同时碱性氨基酸Lys和Arg等含量都较高，Lys含量达到 40.444 mg/g，Arg含量达到44.674 mg/g，牡蛎酶解产物中锌含量较高可能与其有关^[32]。酶解产物中含有18种氨基酸，包含8种必需氨基酸，氨基酸组成比较全面，同时不同超滤组分的氨基酸组成也较平均，因此可以为部分有锌需求的食品进行添加，不但可以达到补锌的目的，而且能增加其营养成分。

2.8 酶解产物不同超滤组分中总锌含量分析

酶解产物不同超滤组分的锌含量见图9。

由图9可知，锌含量由高到低为＞10 kDa，8～10 kDa，5～8 kDa，3～5 kDa，＜3 kDa，其中＞10 kDa的超滤组分中锌含量最高，达到673.819 mg/kg。根据食品安全国家标准GB 28050—2011中的要求，富锌食品的标准为≥45 mg/kg。因此，从总锌含量来看，酶解产物中各超滤组分均达到了富锌的标准。

3 结论

牡蛎是一种营养丰富、蛋白质含量高的水产品，其锌含量是自然界中最高的。本研究通过酶解法制备富锌低分子牡蛎肽，确定酶解工艺的最佳条件为加酶量1.6%、料液比1∶4、酶解温度50 ℃、pH 6.5、酶解时间4 h，在此方案下得到的水解度为49.581%，酶解产物的锌含量（以干基计）为680.831 mg/kg。结果表明，超声辅助酶法可以提高牡蛎的水解度，同时酶解产物和超滤组分的氨基酸组成较完善，均含有18种氨基酸且与锌含量相关的氨基酸含量较高；相对分子量分布图表明酶解产物中小分子肽含量较多，小于1 000 Da的组分占比81.87%；各超滤组分锌含量都达到富锌的标准。

在酶解过程中释放的锌相对其余锌补充剂而言能在人体内被更好地吸收利用，并且由于酶解产物中的锌含量较高，因此可少量添加在食品中，达到富锌的目的。同时由于牡蛎酶解产物中含有的小分子肽多，在补充锌元素的过程中也会有更多有益身体的活性肽发生作用，具有良好的应用前景，为下一步产品的开发研究奠定基础。

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