大豆分离蛋白、豌豆分离蛋白和小麦面筋蛋白相互作用对高水分植物蛋白肉品质特性的影响

俎新宇 赵亚男 陈星烁 王新新 张树成 赵秀兰 赵祥忠 梁艳

摘要：混合多种蛋白原料以创造具有所有原料特征的人造肉产品已经在食品领域得到研究。然而，在高水分植物蛋白肉生产领域暂未得到研究，目前也没有对使用大豆分离蛋白（SPI）、豌豆分离蛋白（PPI）和小麦面筋蛋白（WGP）的混合原料开发植物蛋白肉的研究。该研究的目的是减少植物蛋白肉生产的经济成本，考察由SPI、PPI和WGP共混制备的植物蛋白肉是否比仅用SPI和PPI、SPI和WGP制备的植物蛋白肉具有更好的品质特性以及考察SPI、PPI和WGP以不同比例混合时蛋白之间的相互作用对高水分植物蛋白肉品质特性的影响。研究结果表明，WGP占比的增加增大了产品的硬度和咀嚼性，所有的混合原料基样品均呈现很好的组织化结构，当样品配比为P20W30时达到了最高的组织化度（2.14±0.07），混合蛋白原料也使产品的持水率增加，表观观察和SEM也显示3种混合蛋白原料产品有着更好的拉丝效果和纤维化结构，此外，傅里叶变换红外光谱表明混合蛋白原料产品主要以稳定的β结构存在，WGP占比的增加降低了产品的流变性能。总的来说，该研究表明混合3种蛋白制备的植物蛋白肉有着更好的品质特性。

关键词：混合蛋白；高水分植物蛋白肉；双螺杆挤压；品质特性

中图分类号：TS201.21

文献标志码：A

文章编号：1000-9973（2024）06-0036-07

Effect of Interaction of Soy Protein Isolate， Pea Protein Isolate and

Wheat Gluten Protein on Quality Characteristics of

High-Moisture Plant Protein Meat

ZU Xin-yu¹， ZHAO Ya-nan¹， CHEN Xing-shuo¹， WANG Xin-xin¹， ZHANG Shu-cheng²，

ZHAO Xiu-lan³， ZHAO Xiang-zhong^1*， LIANG Yan^1*

（1.School of Food Science and Engineering， Qilu University of Technology （Shandong Academy of

Sciences）， Jinan 250353， China; 2.Yantai Shuangta Food Co.， Ltd.， Zhaoyuan 265404，

China; 3.School of Public Health， Shandong University， Jinan 250100， China）

Abstract： The blending of multiple protein raw materials to create artificial meat products with all raw material characteristics has been investigated in the food field. However， it hasn't been studied in the field of high-moisture plant protein meat production field yet， and there are no studies on the development of plant protein meat using blended raw materials of soy protein isolate （SPI）， pea protein isolate （PPI） and wheat gluten protein （WGP）. The objectives of this study are to reduce the economic cost of plant protein meat production， to investigate whether plant protein meat prepared by blending SPI， PPI and WGP has better quality characteristics than plant protein meat prepared with only SPI and PPI， SPI and WGP， and to investigate the effect of protein interaction when SPI， PPI and WGP are blended in different ratios on the quality characteristics of high-moisture plant protein meat. The results show that the increase of the ratio of WGP increases the hardness and chewiness of the product， and all the blended raw material-based samples show a good texture structure， with the highest texture degree of 2.14±0.07 when the sample ratio is P20W30. Blending protein raw materials also increases the water holding capacity of the product， and the appearance observation and SEM also show that the product of the three blended protein raw materials has better wire drawing effect and fibrotic structure. In addition， Fourier transform infrared spectroscopy indicates that the product of blended protein raw materials mainly exists in a stable β structure， and the increase of WGP ratio reduces the rheological properties of the product. Overall， this study shows that the plant protein meat prepared by blending the three proteins has better quality characteristics.

Key words： blended proteins; high-moisture plant protein meat; twin-screw extrusion; quality characteristics

收稿日期：2023-11-28

基金项目：山东省重点研发计划项目（2020CXGC010604）

作者简介：俎新宇（1999—），男，硕士研究生，研究方向：蛋白质工程。

*通信作者：赵祥忠（1969—），男，副教授，硕士，研究方向：海洋食品与生物技术。

梁艳（1984—），女，副教授，博士，研究方向：蛋白质工程。由于消费者对肉制品可持续替代品的兴趣日益增长，植物性肉类类似物的市场潜力不断增大^[1]。植物蛋白肉的成功与否取决于它们对真正肉类的各种特征的模仿程度。植物蛋白肉因其与传统肉类食品在理化性质上的相似性、无胆固醇、高营养价值和易加工储存方面的优势成为替代传统肉类食品的最佳选择^[2-3]。根据制备植物蛋白肉水分含量的不同，分为低水分挤压（水分含量为20%～40％）和高水分挤压（水分含量为50%～70%）^[4]。本研究使用高水分挤压技术，通过双螺杆挤出机制备的产品纤维化程度更高、质地均匀且富有传统肉类的弹性、韧性和组织化状态。尤其是高水分挤压可以实现低水分挤压蒸煮过程中不能实现的细腻组织化结构^[5]。

蛋白质原料的质量、种类、含量、功能特性和混合比例是影响植物蛋白肉产品组织化纤维结构形成的关键因素，尤其是不同种类蛋白质原料的混合比例是影响植物蛋白肉与真正肉类相似度的关键因素^[6]。大豆蛋白因其良好的加工特性、均衡的营养价值和相对低廉的价格而被认为是生产植物蛋白肉的理想选择^[7]。目前市场上的植物蛋白肉主要以大豆分离蛋白为原料^[8-9]。Lee等^[10]研究了大豆分离蛋白和水稻分离蛋白对植物蛋白肉理化特性的影响，其研究结果表明两种蛋白组合比仅用一种蛋白制成的肉类类似物具有更好的品质。例如纯大豆分离蛋白生产的产品虽然成本较低，但其豆腥味严重，且含有潜在的过敏原和抗营养因子^[11]。相比于大豆分离蛋白，豌豆分离蛋白不存在转基因问题，由于豌豆分离蛋白的低致敏性和高营养价值，且豌豆分离蛋白富含必需氨基酸赖氨酸和支链氨基酸，其逐渐成为国内外植物蛋白肉的优质原料^[12]。Kaleda等^[13]以豌豆分离蛋白和燕麦蛋白混合物为原料研究了两种混合蛋白对植物蛋白肉品质特性的影响，发现添加30%豌豆分离蛋白条件下产品的组织化度最高。小麦面筋蛋白有着优异的黏弹性、伸长率和热凝固性，所以被广泛用于生产植物蛋白肉^[8]。小麦面筋蛋白特有的黏弹性使以其作为原料生产的植物蛋白肉更容易形成网状结构。Schreuders等^[14]研究发现豌豆分离蛋白和小麦面筋蛋白结合在120 ℃下挤压可以形成具有很好纤维形态的鸡胸肉类似物。

本研究的目的是探究SPI、PPI和WGP 3种蛋白以不同比例混合挤压对植物蛋白肉品质特性的影响，并对SPI、PPI和WGP之间的相互作用对植物蛋白肉组织化度的影响进行研究，通过对植物蛋白肉样品进行色度、质构、持水性、表观结构、SEM扫描电镜、FTIR和流变特性表征，系统探究了混合蛋白原料对植物蛋白肉产品品质特性和组织化度的影响，为开发和生产混合原料基植物蛋白肉产品提供了理论指导。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白（SPI，纯度≥90%）：山东山松生物科技有限公司；豌豆分离蛋白（PPI，纯度≥90%）：烟台双塔食品股份有限公司；小麦面筋蛋白（WGP，纯度≥90%）：封丘县华丰粉业有限公司；复合磷酸盐（CP，纯度≥90%）：江苏燕科生物工程有限公司；溴化钾（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

AHT36双螺杆挤出机 山东真诺智能设备有限公司；Scientz-18N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；EZ-Test生物力学测试仪 日本岛津公司；RH-20流变仪 上海保圣实业发展有限公司；TESCAN MIRA LMS扫描电子显微镜 泰思肯贸易（上海）有限公司；NR10QC+色差仪 深圳市三恩时科技有限公司；Nicolet iS10傅里叶变换红外光谱仪 美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 植物蛋白肉的制备

实验通过同向旋转的双螺杆挤出机进行，挤出机由给料机、高温挤压区（分为7个加热区间）和冷却模具组成。冷却模具尺寸为70 mm×100 mm×1 800 mm（宽×高×长），螺杆长度为125 cm，螺杆直径为4 cm（L/D=31.25）。原料混合物由SPI、PPI和WGP组成，由于研究重点是PPI和WGP的共混，所以SPI的占比是固定的，配方的详细信息见表1，并向其中加入1%的复合磷酸盐作为保水剂。参考Xia等^[15]的方法并根据实际情况改进。使用重量给料机将混合均匀的样品原料以10 kg/h的速率进料到挤出机中。通过入口，以15 kg/h的恒定流量将水注入挤出机中，以获得最终产品中约60%（湿基）的水分含量。螺杆速度设置为800 r/min，从进料到模具的7个区域中的筒体温度设定为40，60，80，120，140，160，150 ℃。使用循环水进行冷却，并将冷却温度设置为50 ℃。从冷却模具的末端收集挤出物，将挤出物冷却至室温，使用真空密封器将挤出物真空包装在塑料袋中，并在－4 ℃下储存，直到进一步分析，以防止保存期间质量劣变影响实验结果。

1.3.2 色度分析

使用色度计对样品的色度进行测量分析。在测量之前，使用标准白板进行校准。参数表示为L^*值（亮度）、a^*值（红色或绿色）和b^*值（黄色或蓝色）。在随机选择的位置对每个样品进行10次测量。标准白板的L₀^*值、a₀^*值和b₀^*值分别为95.13，－0.64和0.68。ΔE表示样品与白板的色差，数值越大表明色差越大，按公式（1）进行计算：

ΔE=（L^*-L₀^*）²+（a^*-a₀^*）²+（b^*-b₀^*）²。（1）

1.3.3 视觉外观

将高水分挤压肉类类似物样品切割成50 mm×6 mm×50 mm（宽×高×长），然后使用相机拍摄外表面图、横切面图和纵切面图，所有照片都在黑色背景和LED光照射下拍摄。

1.3.4 硬度分析

使用生物力学测试仪进行硬度测试，分析了不同比例的SPI、PPI和WGP混合原料制备的植物蛋白肉样品的硬度，将样品切割成30 mm×7 mm×30 mm（宽×高×长），使用疲劳弹性测试的力学球形探头以0.5 mm/s的速度下压样品，将样品压缩至厚度的50%，维持下压状态60 s，使球形探头感受产品的回弹力，取下压至样品厚度的40%时探头感受到的力为样品的硬度。

1.3.5 嫩度、咀嚼性和组织化度分析

样品的咀嚼性和组织化度使用Warner-Bratzler实验来测量，Warner-Bratzler实验可以通过测试样品的最大剪切力来反映植物蛋白肉样品的咀嚼性和组织化度。根据Novakovic＇等^[16]的方法并进行改进，评估样品的咀嚼性和组织化度。将挤出物切割成15 mm×7 mm×50 mm（宽×高×长）。使用沃布氏切刀沿着挤出方向以1 mm/s的速度垂直（F_L）和水平（F_V）切割样品。产品的嫩度用F_L表示，组织化度用F_L与F_V的比值表示（见公式（2）），产品的咀嚼性用剪切能（剪切过程中剪切力的积分）表示。每次分析重复10次，以测量每个样品的F_L和F_V（n=10）。

组织化度=F_LF_V。（2）

1.3.6 持水率测试

采用烘箱干燥法测定高水分植物蛋白肉的持水率（湿基），参考Lee等^[5]的方法并进行改进，取生产48 h后的样品进行研磨（4～5 g），称重记为M_i，使用干燥箱于105 ℃干燥24 h。干燥后冷却1 h至室温，再次称重记为M_d。水分含量按公式（3）计算，每个样品重复5次实验（n=5）。

水分含量（%）=（M_i-M_d）/M_i×100%。（3）

式中：M_i为干燥前样品的质量，g；M_d为干燥后样品的质量，g。

1.3.7 扫描电子显微镜（SEM）分析

通过扫描电子显微镜（SEM）观察不同样品的横截面。将样品直接黏合在导电黏合剂上，并使用溅射涂布机在10 mA下用金喷涂45 s。然后在扫描电子显微镜下以100，300，500倍的放大率观察样品，加速电压为3 kV用于轮廓分析，15 kV用于谱图绘制。检测器为SE2二次电子检测器。

1.3.8 傅里叶变换红外光谱（FTIR）

参考Wang等^[17]的方法并进行改进，取5 mg冻干样品研磨成粉末并过120目筛，将1～2 mg样品与100 mg 溴化钾混合并在研钵中研磨混合物来制备溴化钾圆盘，将100 mg混合物压在圆盘中，使用光谱仪记录IR光谱。扫描次数为64次，分辨率为4 cm^-1，每个样品测试3次，取平均值。使用OMNIC 9.2.86软件对红外图谱进行基线校正、归一化和去卷积化处理，使用PeakFit v4.12软件对4 000～500 cm^-1（酰胺Ⅰ区）进行拟合分析。

1.3.9 流变特性分析

将挤出物冷冻干燥，研磨至粒径＜500μm，并以20%（质量比）的比例分散在蒸馏水中，搅拌1 h。在流变学测试前，将再水合样品真空包装，并在4 ℃冰箱中储存12 h以上，以确保水分分布均匀。将分散液装入流变仪平行板（直径50 mm）正下方，在25 ℃下进行剪切测试，剪切速率为1～100 s^-1。

1.3.10 统计分析

使用方差分析（ANOVA）和皮尔逊相关系数（r）对所有数据进行分析，挤压响应参数和挤压物质地之间的皮尔逊相关系数使用SPSS Statistics 23.0进行统计分析。显著性差异水平P＜0.05为差异显著。使用Origin 2021软件制作数据图。

2 结果和分析

2.1 色度分析

植物蛋白肉的色泽影响着消费者对其的接受程度^[18]。不同SPI、PPI和WGP原料配比对植物蛋白肉色泽的影响见表2。

由表2可知，样品的L^*值随着WGP比例的增加而增加，表明样品的白度不断增加，这是WGP原料自身的白色导致的，这类高WGP原料的产品更适合模仿鸡胸肉。样品的a^*值和b^*值没有显著变化，说明不同原料配比混合添加对样品的a^*值和b^*值没有影响，不同比例的混合原料对颜色的影响不大，这更有利于混合原料植物蛋白肉的进一步开发。

2.2 视觉和宏观状态分析

在不同PPI和WGP比例条件下通过高水分挤压得到手动变形植物蛋白肉样品，通过目测外表结构和内部结构来进行分析。由视觉表面图（见图1中A）可以明显观察到随着WGP比例的增大，样品的颜色逐渐变白，该结果和色度计分析结果一致，SPI、PPI和WGP混合植物蛋白肉更适合模拟白肉，模拟红肉时可以添加植物衍生的红色素。所有混合比例的样品均成型状态好且结构紧致，没有断裂和不成型现象。表面出现了各向异性的挤压痕迹，这是双螺杆挤压导致的正常现象。由横切面图（见图1中B）观察到样品的纤维状结构。SPI、PPI和WGP共混样品均有着很好的纤维状结构，但没有添加WGP的样品拉丝效果偏硬，纤维粗。随着WGP占比的增大，纤维逐渐变细，拉丝效果更明显，该研究结果和Schreuders等^[14]的研究结果一致。本研究在P20W30样品中观察到了最优的纤维化结构，表明SPI、PPI和WGP 3种混合蛋白高水分挤压产品仍然具有致密的组织化结构。由沿垂直挤出方向的切面图（见图1中C）可以看到所有样品均呈现分层状结构，切面图照片证实了植物蛋白肉内部结构是由多个U-shaped层堆叠而成，该发现和Lee等^[5]的研究结果一致。在P20W30样品层状结构中还出现了明显的上下拉丝效果，这与质构数据结果一致。

2.3 质构分析

对于市场而言，质构特性是植物蛋白肉产品最重要的属性。通过力学球形探头和Warner-Bratzler实验测试了产品的质构特征，这种测试设计比传统的TPA测试更具有科学性和参考价值。不同原料配比对高水分植物蛋白肉质构的影响见表3。

由表2可知，随着WGP比例的增加，样品的硬度逐渐增大（P＜0.05）。这是由于小麦面筋蛋白有着优异的黏弹性、伸长率和热凝固性，使其产品更易形成致密的网状结构，从而导致产品硬度的增大。嫩度和咀嚼性也是植物蛋白肉产品重要的属性，嫩度值越小表明产品的嫩度越高。实验结果显示随着WGP占比的增加，产品的嫩度值和咀嚼性不断增大，表明添加WGP导致的致密网状结构可能会使产品不嫩且更有嚼劲，这类食品更适合年轻人食用，而PPI占比高的产品更嫩，这类食品更适合老年人食用，因为老年人的牙齿和颚骨肌肉衰弱，更喜欢柔软且易吞咽的食品。

植物蛋白肉的组织化度是一个重要的质构指标，当纤维形成时，横向切割（F_L）比纵向切割（F_V）需要更大的力，横向和纵向切割之比反映了挤压过程中产品组织化形成的程度和强度^[19]。实验结果表明随着WGP比例的增加，产品的组织化度先显著增大后略微减小，在P20W30时达到最大的组织化度，为2.14±0.07。豌豆分离蛋白在120 ℃以上完全变性，已暴露与其他蛋白交联的键合位点，Schreuders等^[14]的研究也表明在120 ℃以上PPI和WGP开始形成纤维，在140 ℃以上WGP和PPI混合挤压可以形成更多的纤维。本研究中，在160 ℃条件下，大分子的键合位点可以暴露出来，允许更多的相互作用，并导致了更大的键合作用，从而导致在SPI存在的条件下同时添加PPI和WGP有着更高的纤维化结构^[20]。

2.4 持水率分析

高水分植物蛋白肉的水分含量取决于原料混合物在挤压过程中保留水分的程度，产品的持水率和原料蛋白种类有着密切的关系。由图2可知，所有产品的持水率均在44%～53%之间。随着WGP比例的增加，产品的持水率显著增加（P＜0.05），这是因为WGP可以在高温下变性形成致密的网状结构，从而锁住水分来减少水分的流失。样品P0W50的持水率最高，这是因为PPI原料的持水率大约为WGP的50%，原料的差异性导致了产品的持水率不同，该研究结果和Lee等^[5]的研究结果一致，都表明样品的持水率随着PPI比例的增加而降低。还可能是因为WGP比例增加导致了样品内部孔面积减小、孔隙率增加，使得水分不易流失^[21]。

2.5 扫描电子显微镜（SEM）分析

不同原料配比的样品纵切面的SEM图像见图3。

由图3可知，所有样品均表现出整齐的孔状纤维排列结构，这些结构类似真实的肉类纤维。由图3中A可以明显看到有许多分布均匀且大小一致的孔隙，这是由于冷冻干燥后的样品水分缺失，中间出现孔隙。由图3中C可以看出P50W0样品的孔隙最大，这是因为样品经冷冻干燥后拍摄电镜，PPI使孔面积增大，孔隙率减少，导致样品的嫩度值减小，嫩度增加，该观察结果和Warner-Bratzler实验中测试的产品嫩度值结果一致，结果表明PPI会使产品的孔面积增大。随着WGP占比的增加，可以明显看出产品的孔面积减小，但孔隙率增加且分布均匀，这是由于产品原料中的WGP形成多孔网络结构，使得样品各向异性降低，此发现和表观分析结果一致，这种形态使得高WGP占比的产品有着更好的组织化度，拉丝效果明显，此结果与质构分析结果一致，证实了样品P20W30有着最好的拉丝效果，和传统肉类最相似。

2.6 傅里叶变换红外光谱分析

傅里叶变换红外光谱是表征蛋白质结构和构象常用的方法。不同原料配比的植物蛋白肉样品红外光谱图见图4。

由图4可知有5个吸收带，位于约3 300，2 930，1 635，1 520，1 230 cm^-1处。3 300 cm^-1处的吸收带是因为分子间氢键中O—H和N—H的拉伸振动^[22]。WGP占比的增加导致了图谱的红移。2 930 cm^-1处的吸收带是因为蛋白质分子中的—CH₃和—CH₂中碳氢键的伸缩振动^[16]。1 635 cm^-1处的吸收带是酰胺Ⅰ带，主要归因于蛋白质中C—O的拉伸。1 520 cm^-1处的吸收带是酰胺Ⅱ带，主要归因于N—H的弯曲振动和C—N的拉伸振动。1 230 cm^-1处的吸收带是酰胺Ⅲ带，主要归因于C—N的拉伸振动和N—H的弯曲振动^[23]。

酰胺Ⅰ区是对蛋白质二级结构敏感的区域，常用酰胺Ⅰ带来计算蛋白质的二级结构^[24]。样品中蛋白质二级结构的每个构象所占的比例见表4。

由表4可知，α-螺旋结构约占13%～16%，β-折叠约占44%～45%，β-转角约占26%～28%，无规则卷曲约占12%～13%。所有原料配比生产的产品都以β-折叠和β-转角为主要的二级结构，其次是α-螺旋和无规则卷曲，这表明所有样品主要以稳定的β结构存在，其中样品P20W30最稳定。

2.7 流变特性分析

对于植物蛋白肉的研究，了解其流变学特性是改善其质量的先决条件。不同原料配比的产品的表观黏度随着剪切速率增加的变化见图5。

由图5可知，随着剪切速率的增加，复水粉末样品的黏度均呈逐渐下降的趋势，在0～30 s^-1黏度急剧下降，随着剪切速率的增加，系统所需的剪切应力逐渐稳定，样品黏度的下降速率变慢并趋于平缓，在剪切速率超过60 s^-1后黏度基本没有变化，是典型的剪切稀化的非牛顿流体行为，这是由于高浓度的生物聚合物具有典型的剪切减薄行为^[25]。在高水分挤压中，加入的水主要转化为挤压产品中的冻结水，在蛋白质挤压过程中起到润滑和降黏的作用。在同一剪切速率下，随着WGP占比的增加，样品的黏度也增加，WGP的添加降低了样品的流变性能。

3 结论

本研究以SPI、PPI和WGP为原料，通过双螺杆挤出机研究了在高水分挤压中3种混合蛋白原料对高水分肉类类似物品质特性的影响。结果发现所有样品的组织化度均大于1，其中P20W30样品有着最高的组织化度（2.14±0.07），P20W30样品的视觉拉丝效果和微观结构各向异性比两种蛋白混合的P50W0样品更明显。随着WGP比例的增加，样品的咀嚼性和持水率显著增加，WGP的添加降低了产品的流变特性，3种混合蛋白原料制备的产品以稳定的β结构存在。总的来说，本研究以SPI为主要原料和其他两种蛋白混合不仅降低了生产成本，而且对产品的品质特性有着明显的提升作用，这些结果表明混合蛋白原料制备的植物蛋白肉可以用来模仿真肉。

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