精油对腌制芥菜发酵过程中品质指标的影响

吴昕怡 田浩 朱志妍 王瀚墨 李雪瑞 刘秀嶶

摘要：腌制芥菜发酵周期长，发酵过程中易受微生物污染。因此，该研究以8个复配精油组合分别处理腌制芥菜，考察不同精油组合对腌制芥菜发酵过程中理化指标（pH、总酸和还原糖）与微生物指标（菌落总数、乳酸菌和酵母菌）的影响，结合灰色关联度分析，以期找到一个既不影响腌制芥菜正常发酵，又能抑制有害菌生长的最佳精油组合。研究结果表明，精油对腌制芥菜中乳酸菌繁殖的影响较小，且能够显著抑制酵母菌和其他微生物的生长（P＜0.05），保证腌制芥菜的品质，最优精油组合为B组：柠檬+香茅+肉豆蔻。该研究可为腌制芥菜的绿色加工提供数据支撑。

关键词：腌制芥菜；复配精油组合；发酵过程；灰色关联度；抑菌

中图分类号：TS205.5

文献标志码：A

文章编号：1000-9973（2024）06-0102-06

Effect of Essential Oil on Quality Indexes of Pickled Mustard

in Fermentation Process

WU Xin-yi， TIAN Hao， ZHU Zhi-yan， WANG Han-mo， LI Xue-rui， LIU Xiu-wei^*

（Institute of Agro-products Processing， Yunnan Academy of Agricultural Sciences，

Kunming 650221， China）

Abstract： The fermentation period of pickled mustard is long and it is susceptible to microbial contamination in the fermentation process. Therefore， eight combinations of compound essential oils are used to treat pickled mustard respectively， and the effects of different essential oil combinations on physicochemical indexes （pH， total acid and reducing sugar） and microbial indexes （total bacterial count， lactic acid bacteria and yeast） in the fermentation process of pickled mustard are investigated， and then grey correlation analysis is combined to find the optimal combination of essential oils which not only does not affect the normal fermentation of pickled mustard， but also inhibits the growth of harmful bacteria. The results show that essential oil has little effect on the propagation of lactic acid bacteria in pickled mustard， could significantly inhibit the growth of yeast and other microorganisms （P<0.05）， and could ensure the quality of pickled mustard. The optimal combination of essential oils is group B： lemon+citronella+nutmeg. This study can provide data support for the green processing of pickled mustard.

Key words： pickled mustard; compound essential oil combination; fermentation process; grey correlation;

anti-basteria

收稿日期：2023-12-07

基金项目：云南省科技厅重大科技专项（202202AE090017）

作者简介：吴昕怡（1992—），女，助理研究员，硕士，研究方向：农产品精深加工。

*通信作者：刘秀嶶（1982—），女，副研究员，博士，研究方向：生物资源挖掘与利用。

芥菜（Brassica juncea）是十字花科芸苔属一年生草本植物，在全国各地均有栽培，年产量可达4 800万吨^[1]，同时芥菜具有重要的经济意义，我国通过大力推广芥菜种植，有力地促进了农业产业结构调整，助力农户增收^[2]。芥菜作为食用蔬菜的历史悠久，在中国、美国、印度、日本和大多数欧洲国家都很受消费者欢迎^[3]。芥菜因有辛辣味，作为新鲜蔬菜的消耗量很小，通常需要腌制加工后食用^[4]。我国蔬菜的腌制加工已经拥有几千年的历史^[5]，腌制是常见的发酵加工方式之一，通过发酵可以去除食品中令人不愉快的感官物质，并赋予食品独特的风味^[6]。

发酵蔬菜一般由乳酸菌发酵获得，是中国的传统菜肴^[7]。传统的腌制芥菜工艺发酵周期长^[8]，一般在发酵过程中会添加山梨酸钾、焦亚硫酸钠等食品添加剂或其他合成防腐剂来抑制微生物的生长繁殖^[4]。近年来，消费者对食品安全的重视程度日益增加，越来越担心合成防腐剂的安全问题和对健康的负面影响，使用天然防腐剂在食品加工产业变得越来越受欢迎^[9]。

植物精油具有广泛的生物活性，包括抗氧化、抗菌和抗病毒等^[10]，在食品工业领域应用广泛。许多植物精油可以替代合成防腐剂，用作肉类、肉制品、蔬菜、水果、乳制品的防腐剂，更加天然、环保且安全^[11-12]。已有研究显示，在发酵蔬菜中加入紫苏精油可以抑制有害菌的生长，有效改善发酵蔬菜的“生花”腐败现象^[13]。而植物精油之间存在加性或协同作用，多种植物精油复配可显著增加抗菌作用^[14]，但目前尚没有关于复配精油在发酵蔬菜中的应用研究。

本研究针对泡菜中“生花”腐败问题，筛选GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中24种植物精油，随机复配，制备了8个精油组合，研究精油在腌制芥菜发酵过程中对微生物的影响，同时通过测定pH、总酸、还原糖等品质指标，进一步评价精油处理对腌制芥菜质量的影响，使用灰色关联度分析筛选最适精油组合，为筛选优质天然防腐抑菌材料、优化腌制芥菜发酵工艺、研发腌制芥菜绿色加工技术提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜芥菜、食盐：市售；鼠尾草、薰衣草、茶树、香橼、肉豆蔻、柠檬香茅、姜、芫荽籽、香茅、百里香、佛手柑、山苍子、冬青、胡萝卜籽、白千层、红桔、葡萄柚、肉桂、莳萝、牛至、丁香叶、丁香花苞、薄荷、芹菜籽精油：法国Florihana公司；平板计数琼脂（PCA）、MRS琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）：青岛海博生物技术有限公司；氯化钠、氢氧化钠、四水合酒石酸钾钠、无水亚硫酸钠、硼砂、磷酸二氢钾、苯酚（均为分析纯）：广东光华科技股份有限公司；对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、3，5-二硝基水杨酸（均为分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；葡萄糖、氢氧化钠标准溶液（0.100 0 mol/L）：上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

AUY220型分析天平 日本岛津公司；KQ5200E 型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；XMT-DA型电热恒温水浴锅 余姚市亚星仪器仪表有限公司；Spectrophotometer 1510酶标仪 美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 实验方法

1.3.1 腌芥菜制作

对照组芥菜：参照NY/T 3340—2018中的方法腌制，将新鲜芥菜洗净后放入泡菜坛中，用水煮沸后放凉，加入食盐，配制成含盐量为8%的盐水，向泡菜坛中加入盐水，盐水与芥菜的质量比为2∶1，自然发酵90 d。处理组芥菜：在对照组芥菜腌制方法的基础上，添加不同组合精油，每种精油的添加量均为0.01%（以盐水质量计），添加精油的组合见表1。每隔15 d取样一次，90 d内共取样6次，获得样本162份，测定相关指标。

1.3.2 微生物指标测定

菌落总数：参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》中的方法测定；乳酸菌：参照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》中的方法测定；酵母菌：参照GB 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》中的方法测定。

1.3.3 理化指标测定

pH值：采用pH计直接测定；总酸含量：参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》中的直接滴定法测定；亚硝酸盐含量：参照GB 5009.33—2010《食品国家安全标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的分光光度法测定；还原糖含量：参照GB/T 5009.7—2008《食品中还原糖的测定》中的3，5-二硝基水杨酸法测定。

1.4 灰色关联度分析

为消除原始数据的量纲差异影响，需要对数据做归一化处理。数据归一化处理使用均值法，按公式（1）计算：

分别确定比较序列（精油处理组A～H）和参考序列（对照组CK），并分别计算各评价对象比较序列与参考序列的绝对差值，按公式（2）计算：

分别确定两级最小差值和两级最大差值，按公式（3）、公式（4）计算：

Δmax=maximaxkx₀（k）－x_i（k）。（4）

然后计算每个特征序列与参考序列对应元素的相关系数，系数越小，相关系数差异越大，区分能力越强，ρ通常为0.5，按公式（5）计算：

将关联系数集中为一个值，即求其平均值，得到关联度，按公式（6）计算：

1.5 数据统计与分析

采用Excel 2016对数据进行统计分析，分别采用Prism 5、OriginPro 2021对6个指标进行统计分析并作图。

2 结果与分析

2.1 精油对腌制芥菜发酵过程中微生物指标的影响

2.1.1 菌落总数

图1 菌落总数的变化

Fig.1 Change of total bacterial count

由图1可知，腌制芥菜发酵过程中，菌落总数的变化以15 d为一个周期，先升高后降低之后又升高，在第15天时菌落总数达到峰值，该结果与Rao等^[15]在四川泡菜发酵过程中所获得的结果相似，发酵第16天时，泡菜中菌落总数达到峰值后下降，从第32天开始，泡菜水中的微生物总数又再次升高；其中精油处理组A、D、F、H在发酵全过程中的菌落总数均低于对照组（CK）；在第90天发酵结束时，CK的菌落总数为（5.43±0.005 7） lg CFU/mL，精油处理组A～H的菌落总数均显著低于CK（P＜0.05），菌落总数从高到低为G>C>E>A>H>F>D>B，其中最高的是G组，菌落总数为（5.31±0.035） lg CFU/mL，最低的是B组，菌落总数为（3.93±0.036） lg CFU/mL，这可能是由于精油具有抑菌性，添加精油能够抑制发酵过程中细菌的生长^[16]，其中B组在腌制芥菜发酵过程中抑菌效果最优。

2.1.2 乳酸菌

由图2可知，发酵初期，添加精油会显著抑制乳酸菌的生长；发酵第30天时，精油处理组A～H与对照组（CK）相比，乳酸菌数较少，但此时处理组与对照组之间乳酸菌数差异已经不显著（P>0.05）；发酵后期，至第75天时，精油处理组A、B、C、E、G的乳酸菌数均显著高于对照组（CK），且差异具有统计学意义（P＜0.05）；在第90天发酵结束时，精油处理组A～H的乳酸菌数在（5.33±0.051）～（5.73±0.023） lg CFU/mL，除C组外，均高于对照组（CK），这可能是由于精油对乳酸菌有亚致死作用^[17]，添加精油会显著抑制发酵初期微生物的生长，但随着发酵时间的延长，精油造成的影响减弱，腌制芥菜发酵体系中的乳酸菌进入细胞繁殖阶段，整个发酵过程中逐渐趋于稳定，至发酵结束时，添加精油的处理组中乳酸菌数更高，因此，适当添加精油对产品发酵过程中乳酸菌的影响较小。

2.1.3 酵母菌

酵母菌是引起发酵蔬菜变质的主要微生物之一^[18]，酵母菌的过度生长会降低消费者对发酵产品的感官满足感^[19]。由图3可知，发酵初期，添加精油可以极显著抑制酵母菌的生长，在第15天时，对照组（CK）的酵母菌数为（4.78±0.016） lg CFU/mL，而精油处理组B、C、D、H中均未检出酵母菌，A、E、F、G组中检出酵母菌，但均极显著低于CK（P＜0.01）；随着发酵时间的延长，酵母菌出现变化，精油处理组A、B、D、F在发酵全过程中的酵母菌数均低于CK，尤其是B组与D组，在90 d的发酵周期中，酵母菌数均极显著低于CK（P＜0.01）；在第90天发酵结束时，除C组外，所有精油处理组的酵母菌数均低于对照组（CK），且差异具有统计学意义（P＜0.05）。上述结果表明，添加精油可以显著抑制腌制芥菜发酵过程中酵母菌的生长，防止微生物腐败，具有开发为酵母菌抑制剂的可能性。

2.2 精油对腌制芥菜发酵过程中理化指标的影响

2.2.1 pH值

pH值是判断泡菜质量的指标之一，由图4可知，CK与精油处理组A～H相比，pH值变化趋势基本一致。从发酵开始到第15天，pH值显著降低，在3.43～3.31之间，此时CK与精油处理组相比，pH值差异不显著（P>0.05）；发酵第30天时，pH值略微增加，30 d后相对稳定。在第75～90天时，pH值又缓慢下降，最终CK与精油处理组A～H的pH值均在4.00以下，且差异不显著（P>0.05）。在东北酸菜和四川泡菜等发酵蔬菜的研究中，也存在与本研究相同的变化趋势，Zhou等^[20]研究发现东北酸菜在发酵初期pH值快速下降，之后出现小幅回升；Rao等^[15]在四川泡菜发酵过程中也发现类似现象，在发酵60 d后，泡菜的pH值略微增加。综合上述pH值结果，推测腌制芥菜的发酵分为两个阶段：第一阶段为酸化期，可能是乳酸和其他有机酸的产量增加导致pH值显著下降；第二阶段为稳定期，pH值基本保持平稳，至发酵结束时，pH值在4.00以下，这与Palani等^[21]在酸菜发酵过程中的研究结果相近。

2.2.2 总酸

酸味是腌制芥菜的主要风味，也是其重要的特色之一^[22]。总酸不仅是发酵蔬菜的重要生产指标，也是判断其成熟度的重要参数^[23]。由图5可知，精油处理组A～H与对照组变化趋势基本一致，且在整个发酵周期内，精油处理组A、B、E的总酸含量始终高于对照组（CK）。以上研究结果表明，添加精油不会对腌制芥菜的pH值造成影响，也不会影响腌制芥菜的正常发酵。由于精油组合不同，所含有的生物活性物质不同，在发酵过程中产生的有机酸及其含量不同，因此导致总酸含量不同。总酸含量的升高显著加速了发酵过程，表明添加精油处理组A、B、E发酵的芥菜可能具有更高的酸化性能，而更短的酸化过程可以加速发酵蔬菜生产，减少商业损失，降低生产成本^[24]。

2.2.3 还原糖

还原糖含量可作为发酵蔬菜成熟、微生物生长和风味变化的指标^[25]，微生物利用还原糖作为营养物质，将其分解成乳酸、酒精和二氧化碳，产生多种成分^[26]。由图6可知，精油处理组A在腌制芥菜发酵全过程中还原糖含量始终高于对照组（CK）；发酵第90天时，精油处理组A～H的还原糖含量均高于CK，其中还原糖含量最高的是B组，达到0.134 6 mg/g，显著高于CK（P＜0.05）。这可能是由于微生物的生长繁殖需要利用还原糖作为碳源^[27]，而精油具有抗菌活性，添加精油抑制了腌制芥菜发酵过程中微生物的生长，有效保留了还原糖含量。范龙泉等^[28-29]使用黄芪提取液、山楂提取液分别处理发酵蔬菜时也发现在发酵过程中添加具有抑菌功能的物质可以有效保留发酵蔬菜中的还原糖。

2.3 灰色关联度分析

灰色关联度分析中，关联系数越接近于1，表明参考组和处理组越倾向于一致；相反，关联系数越接近于0，表明参考组和处理组趋向不同^[30]。本研究中以对照组（CK）作为参考组，计算关联系数，结果见图7。

pH与总酸通常作为判断发酵蔬菜质量的标志^[31]，由图7中a可知，pH关联系数排名前三的分别是F（0.753）、B（0.746）与G（0.722），总酸关联系数排名前三的分别是H（0.842）、D（0.753）与B（0.733），关联系数越大，说明精油处理组与对照组（CK）变化趋势越一致，精油处理对pH与总酸的影响越小，对腌制芥菜质量的影响也越小；还原糖的关联系数均大于0.6，表明精油处理组A～H与对照组（CK）相比，还原糖含量变化趋势基本一致，精油处理不会影响腌制芥菜发酵过程中还原糖的变化。

大多数发酵蔬菜产品的生产都高度依赖天然乳酸菌^[22]，因此为了保证腌制芥菜的正常发酵，不能影响乳酸菌的正常生长繁殖，由图7中b可知，与对照组（CK）相比，精油处理组A～H的关联系数均大于0.7，说明乳酸菌的动态变化基本一致，表明添加精油处理不会影响腌制芥菜中乳酸菌的生长，也不会影响芥菜的正常发酵；菌落总数检测的是细菌总数，包含可能影响芥菜正常发酵的某些细菌；酵母菌数量的增加会对发酵蔬菜的质量产生负面影响^[32]，尤其是在发酵后期。因此，与对照组（CK）相比，菌落总数和酵母菌的关联系数越低，表明精油处理组与CK的变化趋势越不同，对两种指标的抑制性越好，越有益于腌制芥菜的正常发酵，由图7中b可知，菌落总数的关联系数排名前三的分别是B（0.548）、H（0.565）与F（0.581），酵母菌的关联系数排名前三的分别是B（0.429）、D（0.450）与A（0.655），因此精油处理组B效果最优。

3 结论

本研究随机制备了8个复配精油组合，考察了精油处理对腌制芥菜发酵过程中菌落总数、乳酸菌、酵母菌、pH、总酸和还原糖的影响，并使用灰色关联度法进一步进行了分析。结果显示：8个精油组合中，发酵结束时pH值均在4.00以下，其中精油处理组F、B、G对pH值的影响最小；在整个发酵周期内，精油处理组A、B、E的总酸含量始终高于对照组（CK），精油处理组H、D、B总酸积累的趋势最接近CK；发酵结束时，精油处理组A～H的还原糖含量均高于CK，且关联系数均大于0.6，表明精油处理不会影响腌制芥菜发酵过程中还原糖的变化；微生物指标中，除C组外，精油处理组A～H的乳酸菌数均高于对照组（CK），且所有处理组的关联系数均大于0.7，表明精油处理不会影响腌制芥菜中乳酸菌的生长，也不会影响腌制芥菜的正常发酵；8个精油组合处理中，菌落总数均显著低于CK（P＜0.05），其中B组最低，表明精油处理可以显著抑制腌制芥菜发酵过程中细菌的生长；酵母菌会影响发酵蔬菜的风味，发酵过程中需要抑制其生长，而精油处理可以显著抑制酵母菌生长，在整个发酵周期中，抑制效果最优的是B组。上述研究结果证明，精油处理不会影响腌制芥菜的正常发酵，B组（柠檬+香茅+肉豆蔻）精油组合效果最优，可以考虑作为合成防腐剂的替代品，在腌制芥菜加工中推广应用。

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