斑点追踪技术在达格列净改善蒽环类药物所致小鼠心脏毒性中的应用研究

摘要：目的 探讨斑点追踪技术在评估达格列净改善蒽环类药物所致小鼠心脏毒性的可行性。方法 将BALB/c雄性小鼠随机分为对照组、表柔比星组和达格列净干预组。达格列净在表柔比星用药前连续给药3 d，然后每间隔1 d给药1次，持续3周（给予10 mg/kg达格列净，灌胃）。表柔比星（3 mg/kg，腹腔注射）或等体积0.9%氯化钠溶液每4天注射1次，持续3周。分别于基线、第3周期化疗后和最后一周期化疗后1 d行常规超声心动图检查和基于斑点追踪技术左心室整体纵向应变（global longitudinal strain，GLS）测量。实验结束后，通过组织学分析评估心肌损伤。结果 与对照组和达格列净干预组比较，表柔比星组表现出明显的心肌细胞结构异常，胶原蛋白含量和心肌细胞凋亡百分比增高。心脏功能方面，表柔比星组在第3周期注射后GLS显著降低（P＜0.05），并且随着累积剂量的增加，GLS持续下降（P＜0.05）；达格列净干预组GLS只在最后一周期化疗结束后表现为轻微减低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。此外，GLS与心肌病理损伤表现出良好的相关性，且与胶原蛋白含量相关性最高（rs=-0.637，P＜0.001）。结论 达格列净干预治疗后可明显改善化疗小鼠的心脏损伤；GLS在评估接受心脏保护性药物后的心功能改善方面是可行的。

关键词：斑点追踪；达格列净；蒽环类药物；心脏毒性

DOI：10.3969/j.issn.1674490X.2024.02.001

中图分类号：R969文献标志码：A文章编号：1674490X（2024）02-0001-08

Study on dapagliflozin in improving cardiotoxicity induced by anthracyclines in mice with speckle tracking technique

BI Liangliang1， ZHAO Hongmei2， LI Cheng3， LI Rui4， SHANG Lina1， DI Guixin1， ZHAO Jinhui1

（1.Department of Ultrasound Diagnosis， Affiliated Hospital of Hebei University，" "Baoding 071000， China; 2.Department of Geriatrics， Affiliated Hospital of Hebei University，" Baoding 071000， China; 3.Physical Examination Center， Affiliated Hospital of Hebei University，" "Baoding 071000， China; 4.Department of Obstetrics， Affiliated Hospital of Hebei University， Baoding 071000， China）

Abstract： Objective" To investigate the feasibility of speckle tracking technique in evaluating the improvement of cardiotoxicity induced by anthracyclines with dapagliflozin. Methods Male BALB/c mice were randomly divided into normal control group， epirubicin group and epirubicin plus dapagliflozin group. Dapagliflozin were administered at three consecutive days before epirubicin treatment， followed by once every other day for 3 weeks （10 mg/kg， p.o.）. Epirubicin （3 mg/kg， i.p.） or an equal volume of 0.9% sodium chloride solution were injected every 4 days for 3 weeks. Conventional echocardiography and measurement of left ventricular global longitudinal strain （GLS） based on speckle tracking technique were performed at baseline， one day after the third Epi dosage and one day after the last chemotherapy. Myocardial damage were evaluated by histological analysis at the end of experiment. Results Compared with control group and epirubicin plus dapagliflozin group， epirubicin group showed significant abnormalities in myocardial cell structure， and an increase in collagen content and percentage of myocardial cell apoptosis. In terms of cardiac function， GLS decreased significantly after the third injection in epirubicin group （Plt;0.05）， and GLS continued to decrease with increasing cumulative dose （Plt;0.05）. GLS only showed slight decrease in epirubicin plus dapagliflozin group after the last chemotherapy， but this difference was not statistically significant（Pgt;0.05）. In addition， there was a good correlation between GLS and myocardial pathological damage， with collagen content showing the highest correlation（rs=-0.637，Plt;0.001）. Conclusion Dapagliflozin can significantly improve the heart damage caused by epirubicin in the mouse model. GLS is feasible for evaluating heart function improvement after receiving cardioprotective drugs.

Key words： speckle tracking technique; dapagliflozin; anthracyclines; cardiotoxicity

作为蒽环类药物的代表，表柔比星在抗肿瘤治疗中应用广泛，但其产生的毒副作用也不容忽视，尤其是心肌损伤在很大程度上制约患者的长期生存［1］。如何合理地治疗和预防肿瘤治疗相关心脏毒性，目前仍缺乏循证医学证据［2］。当前，多数临床研究仍着眼于抗心力衰竭的常规用药在这些患者中的治疗价值，如β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂等［3-5］。研究［6-8］显示，达格列净作为一种新型降糖药物，在有效控制血糖的同时，还能改善心肌损伤。然而，对于达格列净保护抗肿瘤药物诱导心功能不全的研究甚少；并且如何客观地评价其心脏保护作用也一直存在争议。本研究采用达格列净作为保护药物，通过二维斑点追踪技术（two dimensional speckle tracking technology， 2D-STE）左心室整体纵向应变（global longitudinal strain， GLS）检测化疗小鼠模型心功能改善情况。

1材料与方法

1.1实验方案

根据《实验动物管理与使用指南》饲养小鼠。实验方案经河北医科大学第四医院动物护理和使用委员会批准（2019MEC050）。

将30只9～11周的BALB/c雄性小鼠（20～25 g）置于恒温室的鼠笼中，随时取水和食物。1周后，将小鼠随机分为3组：对照组（n=9）、表柔比星组（n=11）和达格列净干预组（n=10）。达格列净在表柔比星用药前连续给药3 d，然后每间隔1 d给药1次，持续3周（给予10 mg/kg达格列净，灌胃）［9］。表柔比星（3 mg/kg，腹腔注射）或等体积0.9%氯化钠溶液每4天注射1次，持续3周［10］。在基线、第3周期化疗后和最后一周期化疗后1 d进行超声心动图检查。随后采集血液样本，尸检中提取心、肝、肾等器官行进一步分析。

1.2观察指标

1.2.1常规超声心动图指标

每组小鼠依次采用3％异氟烷麻醉，并将其仰卧放置在加热垫上（37 ℃）。通过肢体电极进行心电监测。检查过程中，异氟烷的浓度降至1%～2％，以使心电图显示恒定且具有可比性的心率［11］。

采用小动物超声诊断仪（Vevo 2100成像系统，配有MS400超高频线阵换能器）评估小鼠心脏结构及功能。采集胸骨旁左心室长轴切面后，将探头旋转90°，以获取乳头肌水平短轴切面。M模式用于获取常规超声心动图参数：左心室前壁厚度（left ventricular thickness of the anterior wall， LVAW）、左心室后壁厚度（left ventricular thickness of the posterior wall， LVPW）、左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic diameter， LVIDd）、左心室收缩末期内径（left ventricular end-systolic diameter， LVIDs）、左心室射血分数（left ventricular ejection fraction， LVEF）、左心室短轴缩短率（left ventricular shortening fraction， LVFS）。连续采集3个心动周期的数据，计算平均值。

彩色多普勒用于确认二尖瓣口的位置。脉冲多普勒用于测量二尖瓣前向血流频谱E峰和A峰，计算E/A。

1.2.2斑点追踪成像

使用VevoStrain软件（Visual Sonics，加拿大，多伦多）进行斑点追踪脱机分析。胸骨旁左心室长轴切面，放置多个跟踪点实现半自动跟踪小鼠心内膜及心外膜边界，从而获取GLS［12］。负值表示心肌纤维在纵向方向上的缩短（图1）。

1.2.3血液样本分析

经小鼠眼球后静脉采集血样，并将其置于涂有EDTA试管中以进行血液计数分析。

1.3组织学分析

1.3.1形态学检查

将所有小鼠的心脏、肝脏、肾脏切除，洗净后称重。心脏固定于福尔马林液中，石蜡包埋，切片（厚度为5 μm）。组织切片行苏木精－伊红染色，光学显微镜评估心肌病变情况。

1.3.2心脏纤维化分析

天狼星红染色，显微镜下观察小鼠心肌纤维化程度。胶原蛋白含量定义为天狼星红染色的胶原蛋白纤维占总面积的百分比，可使用计算机辅助图像分析系统自动计算得出。

1.3.3心肌细胞凋亡

使用TUNEL试剂盒判定是否存在心肌细胞凋亡。此方法可将凋亡细胞核染成深棕色。显微镜下计算TUNEL阳性心肌细胞的百分比。

1.4统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析。数据的正态分布检验通过Kolmogorov-Smirnov检验证明。接近正态分布的连续变量采用均数±标准差（x±s）表示。偏度分布数据表示为中位数和四分位数。数据比较采用双因素重复测量方差分析。首先判断组间和时间是否存在交互作用，若二者间无交互作用，则比较处理因素的主效应；若二者间存在交互作用，则分析时间和处理因素的单独效应。采用Spearman等级相关分析，以确定变量与病理改变之间的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1药物治疗的一般毒性

在第4周期和第5周期注射后，表柔比星组有2只小鼠死亡，它们的数据被排除在研究结果之外，其他小鼠均完成了实验。与对照组和达格列净干预组相比，表柔比星组小鼠的体质量降低，见表1；心、肝、肾的器官质量减少（图2A）。然而，只有心脏的器官系数明显下降，肝脏和肾脏的器官系数三组间差异无统计学意义，这表明表柔比星对小鼠心脏的影响相对较大（图2B）。

2.2血液样本计数

与对照组和达格列净干预组相比，表柔比星组小鼠的白细胞和红细胞计数以及血红蛋白和血细胞比容均降低。此外，表柔比星对小鼠血小板计数的影响更显著：相对于对照组，表柔比星组小鼠血小板计数增加了约1.5倍（图3）。

2.3组织学发现

苏木精－伊红染色显示，对照组心脏组织未显示任何病变迹象；表柔比星组有6只小鼠（67％）表现出心脏病变，如细胞质空泡化和肌原纤维减少；而达格列净干预组仅有2只小鼠（20％）表现出心脏损伤（图4 A—D）。

天狼星红染色表明，与对照组相比，表柔比星组动物心脏胶原含量显著增加［对照组与表柔比星组分别为（2.4±0.7）％和（4.8±1.6）％，Plt;0.01］；而达格列净干预组心肌组织纤维化程度明显低于表柔比星组（图4 E—H）。

TUNEL染色结果显示，表柔比星组TUNEL阳性心肌细胞凋亡的百分比大大增加，而达格列净干预组小鼠心肌细胞凋亡水平明显降低（图4 I—L）。

2.4表柔比星对常规心脏参数的影响

三组小鼠在基线时的超声心动图检查指标之间差异无统计学意义。实验过程中LVAW和LVPW始终保持稳定；表柔比星组LVIDd显示微弱增加，但差异无统计学意义；LVIDs、LVEF和LVFS均未偏离基线。此外，表征舒张功能的指标E/A在整个实验过程中变化不明显，见表1。

2.5斑点追踪超声心动图

与对照组比较，表柔比星组在第3周期注射后GLS显著降低，并且随着累积剂量的增加，GLS持续下降。相比之下，达格列净干预组GLS只在最后一周期化疗结束后表现为轻微减低，但差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.6心脏毒性评估

相关分析表明，上述超声心动图指标中，只有GLS与心肌病理损伤表现良好的相关性，且与胶原蛋白含量相关性最高（rs=-0.637，P＜0.001），而其他参数均与病理结果无显著相关，见表3。

3讨论

本研究使用雄性小鼠，旨在排除雌激素对实验的影响［13］。此外，超声心动图检查过程中采用的是异氟烷吸入式轻度麻醉：不仅操作简单安全，在检查过程中，还可通过调整麻醉剂量获取小鼠稳定且可比的心率，这对成功获取超声心动图参数至关重要［14］。本研究表明，在整个实验过程中，小鼠的心率是稳定的，未观察到异氟烷对小鼠的不良影响。

蒽环类药物在抗肿瘤治疗中应用广泛，但其诱发的心脏损害已成为严重影响患者治疗和生活质量的重要因素。其中，心力衰竭被认为是最常见的并发症［15］。因此，早期干预、客观评估心脏功能具有重要的临床意义。达格列净是一类新型降糖药物，并且具有改善心肌损伤的作用［8］。有研究［8，16］报道，达格列净短期内能有效抑制心力衰竭的炎症反应，降低炎症因子水平，缓解心肌纤维化。本研究中，达格列净的干预成功地降低了表柔比星所诱发的心肌损伤。达格列净干预组出现心肌细胞质空泡化的发生率明显低于表柔比星组；心肌组织纤维化的程度与表柔比星组之间也存在显著差异；TUNEL染色还证实了达格列净对于心肌细胞凋亡起保护作用。

超声心动图技术中表征收缩功能的指标LVEF在临床中应用广泛。然而研究［17］表明，利用LVEF评价蒽环类药物所致心脏毒性存在一定的局限性，其不能早期发现心脏损伤，一旦出现LVEF明显下降，心功能损害往往难以逆转。本实验中，表柔比星组小鼠的LVEF和LVFS在化疗期间和化疗结束后均无明显变化，与先前的研究结果一致［9］。舒张功能参数E/A仅表现出轻微的降低，但差异无统计学意义。此外，上述指标在表柔比星组和达格列净干预组之间无显著差异。2D-STE是一种用于评估心脏功能灵敏、无创且可重复性高的检查方法［18］。在基于STE的参数中，GLS的优势最为突出，不仅灵敏性和特异性高，对于心肌损伤还具有良好的预测价值［19］。本研究中，表柔比星组GLS随着累积剂量的增加而持续下降；而达格列净干预组的GLS只在最后一周期化疗结束后表现为轻微减低，但差异无统计学意义。在随后的相关分析中，GLS与表柔比星组和达格列净干预组小鼠心肌组织的病理改变表现出良好的相关性，这说明GLS能够早期发现接受心脏保护性药物后的心功能改善。

综上所述，达格列净干预治疗后可明显改善化疗小鼠的心脏损伤，减少细胞质空泡化，缓解心肌纤维化和凋亡程度，对心脏组织起到一定的保护作用。此外，基于2D-STE的左心室GLS在评估接受心脏保护性药物后的心功能改善方面是可行的。

参考文献：

［1］CURIGLIANO G， LENIHAN D， FRADLEY M， et al. Management of cardiac disease in cancer patients throughout oncological treatment： ESMO consensus recommendations［J］. Ann Oncol， 2020， 31（2）： 171-190. DOI： 10.1016/j.annonc.2019.10.023.

［2］赵睿，程蕾蕾.超声斑点追踪显像在肿瘤心脏病学中的应用［J］.心血管病学进展， 2018， 39（2）： 138-143. DOI： 10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2018.02.002.

［3］王媚，张楠，徐柳月，等.β受体阻滞剂对蒽环类药物所致亚临床心脏毒性疗效的meta分析［J］.现代医药卫生， 2021， 37（17）： 2937-2942. DOI： 10.3969/j.issn.1009-5519.2021.17.014.

［4］ZHAN T， DANIYAL M， LI J， et al. Preventive use of carvedilol for anthracycline-induced cardiotoxicity： asystematic review and meta-analysis of randomized controlled trials［J］. Herz， 2020， 45（Suppl 1）： 1-14. DOI： 10.1007/s00059-018-4779-y.

［5］MEATTINI I， CURIGLIANO G， TERZIANI F， et al. Safe trial： an ongoing randomized clinical study to assess the role of cardiotoxicity prevention in breast cancer patients treated with anthracyclines with or without trastuzumab［J］. Med Oncol， 2017， 34（5）： 75. DOI： 10.1007/s12032-017-0938-x.

［6］周洁，吴新华，严妍，等.达格列净对血糖控制不佳的2型糖尿病伴肥胖患者胰岛功能的影响［J］.中国医药导报， 2022， 19（33）： 75-78. DOI： 10.20047/j.issn1673-7210.2022.33.16.

［7］高燕，朱庆颖，栾明亚，等.托伐普坦联合达格列净对心衰大鼠心肌纤维化的影响［J］.山东大学学报（医学版）， 2022， 60（12）： 13-18， 25. DOI： 10.6040/j.issn.1671-7554.0.2022.0564.

［8］WANG C Q， QIN Y T， ZHANG X J， et al. Effect of dapagliflozin on indicators of myocardial fibrosis and levels of inflammatory factors in heart failure patients［J］. Dis Markers， 2022， 2022： 5834218. DOI： 10.1155/2022/5834218.

［9］张雪娇，刘洁婷，李鲁新，等.达格列净对1型糖尿病小鼠心肌损伤的影响及机制研究［J］.中国临床药理学与治疗学， 2023， 28（3）： 257-265. DOI： 10.12092/j.issn.1009-2501.2023.03.003.

［10］OHLIG J， HENNINGER C， ZANDER S， et al. Rac1-mediated cardiac damage causes diastolic dysfunction in a mouse model of subacute doxorubicin-induced cardiotoxicity［J］. Arch Toxicol， 2018， 92（1）： 441-453. DOI： 10.1007/s00204-017-2017-7.

［11］POON Y Y， TSAI C Y， HUANG Y H， et al. Disproportional cardiovascular depressive effects of isoflurane： serendipitous findings from a comprehensive re-visit in mice［J］. Lab Anim， 2021， 50（1）： 26-31. DOI： 10.1038/s41684-020-00684-w.

［12］BEYHOFF N， BRIX S， BETZ I R， et al. Application of speckle-tracking echocardiography in an experimental model of isolated subendocardial damage［J］. J Am Soc Echocardiogr， 2017， 30（12）： 1239-1250.e2. DOI： 10.1016/j.echo.2017.08.006.

［13］YAN H， YANG W B， ZHOU F H， et al. Estrogen protects cardiac function and energy metabolism in dilated cardiomyopathy induced by loss of cardiac IRS1 and IRS2［J］. Circ Heart Fail， 2022， 15（6）： e008758. DOI： 10.1161/CIRCHEARTFAILURE.121.008758.

［14］TOMSITS P， VOLZ L， XIA R B， et al. Medetomidine/midazolam/fentanyl narcosis alters cardiac autonomic tone leading to conduction disorders and arrhythmias in mice［J］. Lab Anim， 2023， 52（4）： 85-92. DOI： 10.1038/s41684-023-01141-0.

［15］TOCCHETTI C G， CADEDDU C， LISI D D， et al. From molecular mechanisms to clinical management of antineoplastic drug-induced cardiovascular toxicity： a translational overview［J］. Antioxid Redox Signal， 2019， 30（18）： 2110-2153. DOI： 10.1089/ars.2016.6930.

［16］BUTT J H， DEWAN P， DEFILIPPIS E M， et al. Effects of dapagliflozin according to the heart failure collaboratory medical therapy score： insights from DAPA-HF［J］. JACC Heart Fail， 2022， 10（8）： 543-555. DOI： 10.1016/j.jchf.2022.03.009.

［17］PLANA J C， GALDERISI M， BARAC A， et al. Expert consensus for multimodality imaging evaluation of adult patients during and after cancer therapy： a report from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging［J］. Eur Heart J Cardiovasc Imaging， 2014， 15（10）： 1063-1093. DOI： 10.1093/ehjci/jeu192.

［18］GHERBESI E， BERGAMASCHI L， CUSMANO I， et al. The usefulness of speckle tracking echocardiography in identifying subclinical myocardial dysfunction in young adults recovered from mild COVID-19［J］. Echocardiography， 2022， 39（9）： 1190-1197. DOI： 10.1111/echo.15431.

［19］GMEZ-OCHOA S A， ROJAS L Z， HERNNDEZ-VARGAS J A， et al. Longitudinal speckle tracking strain abnormalities in chagas disease： a systematic review and meta-analysis［J］. J Clin Med， 2022， 11（3）： 769. DOI： 10.3390/jcm11030769.

（责任编辑：刘俊华）