病毒载体遗传毒性评价方法研究进展

何伟伟，周长慧，郑明岚，李嫚琪，崔文腾，方雅励，王晓炜，常艳

（1.中国医药工业研究总院，上海益诺思生物技术股份有限公司，上海 201203；2.国家药品监督管理局药品审评检查长三角分中心，上海 201203；3.深圳市药品检验研究院，广东 深圳 518057）

近年来，基因治疗在遗传疾病和罕见病领域取得显著成果，越来越多基于病毒载体的基因治疗产品被监管机构批准上市。如何安全有效地将外源基因导入体外细胞或体内组织，是安全高效实现基因治疗的关键。目前主流的基因治疗载体分为病毒载体和非病毒载体，其中病毒载体又可分为整合型病毒载体和非整合型病毒载体。整合型病毒载体包括逆转录病毒载体和慢病毒（lentivirus，LV）载体等；非整合型病毒载体包括腺病毒载体和腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）载体等。AAV和LV载体在目前临床试验中应用较为广泛［1］。

病毒载体因其自身优势在基因治疗中表现突出，但也暴露了相关安全问题，如遗传毒性。病毒载体介导的遗传毒性是由炎症、随机插入干扰正常基因、原癌基因的激活和插入突变等导致的［2-3］。通常表现为基因表达失调，甚至导致克隆扩增和肿瘤发生［4-5］。载体介导的遗传毒性可受病毒类型、整合位点和靶细胞类型的影响，不同载体具有不同细胞特异性整合倾向［6］。国际人用药品注册技术协调会（International Conference on Harmonization，ICH）指南S2（R1）中描述了传统的遗传毒性标准组合试验，该试验存在局限于检测DNA损伤或突变及只能得到短期结果的缺点［2］，因此不适用于评估载体介导的遗传毒性。面对复杂多变的病毒载体整合特点及可能引发的相关安全问题，对病毒载体进行潜在遗传毒性风险评估势在必行。本文对目前应用广泛的AAV 和LV 载体的生物学特性和整合途径进行简介，对已有的病毒载体介导的遗传毒性评价方法进行综述，并对建立准确快速的病毒载体介导的遗传毒性的评价体系进行展望，以期为后续研究提供参考。

1 AAV和LV载体

1.1 AAV载体

AAV 属于细小病毒科依赖病毒属，是一类微小、无被膜的线性单链DNA 病毒［7］，同时也是一种缺陷型病毒，需要辅助病毒的存在才能感染宿主细胞，产生新病毒颗粒。无辅助病毒存在时，野生型AAV（wild type-AAV，WT-AAV）只能整合到19号染色体长臂上，形成潜伏感染，随宿主细胞染色体复制而复制［7-8］。与WT-AAV 不同，重组AAV（recombination AAV，rAAV）载体通常是将WT-AAV 中的rep基因和cap基因用目的基因所取代，只保留AAV 基因组两端的2 个反向重复序列。rAAV 作为基因治疗载体，通过在载体上移除rep与cap消除其整合能力，因此缺乏rep介导的主动整合，在宿主细胞中主要形成反向重复序列融合片段，称为环状连接游离体或游离串联体［9］。rAAV 载体能同时感染分裂期和静止期细胞，在未分裂细胞中，这些rAAV 载体基因组在宿主细胞生命周期中保持完整；在分裂细胞中，游离DNA 不随宿主细胞DNA 复制，rAAV 载体的DNA 通过细胞分裂而丢失［10-11］。然而，rAAV 载体仍能以低频率随机整合到靶细胞基因组中，可能是宿主细胞DNA修饰酶介导了该整合过程，同时造成了潜在的遗传毒性风险［9］。

多数研究发现，rAAV 载体整合有2种方式。一种是随机整合，发生在DNA 损伤位点的非同源位置，通过非同源末端与宿主基因组连接发生整合；另一种是靶向整合，通过同源重组发生在特定位点［12］。rAAV 载体的整合位点通常位于活性转录单元和相关注释附近，整合事件发生在CpG 岛和富含GC 片段的频率逐步增加，这与活性转录有关［13-14］。但不同物种间也存在整合位点偏好性，如新生小鼠的整合“热点”包括Rian 位点、白蛋白和甲胎蛋白［15］；犬的整合“热点”有早期生长反应基因、细胞周期蛋白D1 基因、双特异性磷酸酶1 基因和白蛋白［14］；非人灵长类动物和人类肝细胞相关研究也报道了白蛋白中的多个rAAV整合事件［16-17］。rAAV载体之所以能作为基因治疗载体，是因其在人类中的低遗传毒性特征，且无直接证据表明rAAV载体可在人类中介导宿主的遗传毒性。目前普遍认为，rAAV载体基因组仍然主要以附加体的形式存在于宿主细胞核［18］。

1.2 LV载体

LV 是逆转录病毒的一个属，为二倍体RNA 病毒，因其潜伏期长而被称为LV［1］。LV 的基因组整合过程首先从整合酶识别病毒的长末端重复序列开始，此时整合酶将宿主细胞的DNA 切断，产生的黏性末端与病毒的DNA 相连接。整合进去的前病毒DNA 会转录出病毒蛋白的mRNA 和病毒基因组RNA，二者在宿主细胞的细胞质中包装成完整病毒颗粒，并以出芽方式释放到细胞外［19-21］。人类免疫缺陷病毒（human immune deficiency virus，HIV）载体是应用最早、最广泛的LV 载体，因其转运外源基因稳定且高效而成为基因转导常用的载体工具。研究表明，HIV 载体更倾向于整合到转录活跃基因的内含子中下游区域［22］，对转录活跃基因的转录单位有一定偏好性，但不包括转录起始单位［23-25］。LV载体整合位点的偏好性还会随转导细胞的活性状态而变化，如HIV 均可整合在静息状态和激活状态的CD4+T 细胞的活性转录单元中，但激活状态的CD4+T 细胞的整合位点更常见于基因密集、CpG 岛密集和G/C 碱基富集的基因组区域［26］。分裂和非分裂的啮齿动物细胞之间的整合也有区别，相较于非分裂细胞，自失活（self inactivating，SIN）载体在分裂细胞中的整合优先发生在基因编码区域［27］。此外，对发生HIV 整合的靶DNA 上的核小体进行结构分析表明，核小体表面的向外DNA主凹槽有利于整合的发生，由此可以诱导原癌基因（如Evi1和B-Raf）激活［2］。LV 载体在基因治疗中表现出高效性和安全性，但随机整合的特性仍会引发难以预料的插入突变。因此，第1 代～第4 代LV 载体通过改造包膜蛋白、去除辅助蛋白、添加土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件，以及开发SIN 载体和整合缺陷LV（integration-deficient LV）等方式，有效减少载体整合且提高病毒载体滴度［28］。

2 病毒载体介导的遗传毒性评价方法

以病毒载体为递送载体的基因治疗产品，由于复杂的生物组成和特殊的作用机制，介导的遗传毒性区别于传统的遗传毒性，主要为整合插入导致细胞发生基因突变、基因失活/激活或癌变的风险，因此其安全性评价不能完全采用化学药的传统毒理学方法［2-4］。全基因组分析、整合位点分析、核型分析和评估转化潜力试验等方法能够从不同角度对病毒载体介导的遗传毒性进行评价，具有针对性、高效性、准确性等特点。

2.1 脱靶修饰的全基因组分析

近年来，CRISPR/Cas9 系统已成为医学领域最具潜力的基因编辑工具。CRISPR/Cas9 系统的特异性主要取决于单链导向RNA（single guide RNA，sgRNA）的识别序列。由于设计的sgRNA 可能会与非靶点DNA序列形成错配，导致非预期的基因突变效应，该效应称为脱靶效应。CRISPR/Cas9 技术在被广泛应用的同时，发生脱靶效应的频率也在增加［29］。CRISPR/Cas9 系统需要结合有效的体内递送方式才可能最终转化为临床疾病治疗工具。目前可借助病毒载体或非病毒载体进行递送，其中AAV载体最为安全。AAV载体能感染分裂和非分裂细胞，并具有低免疫原性、高组织特异性、高转导效率等优势［30］。理想的基因编辑递送工具应兼具瞬时和高效的特点，以确保治疗的安全性和有效性。而AAV载体作为CRISPR/Cas9系统的递送载体，进入细胞后可支持CRISPR/Cas9 系统持续表达Cas 蛋白；相较于瞬时表达，sgRNA 介导的脱靶概率将增大，加之AAV 载体可整合进宿主基因组的潜在风险，将进一步放大sgRNA介导的脱靶效应，造成不同程度的遗传毒性风险。全基因组测序技术是对某物种基因组进行测序得到其基因组序列的方法，分为体内全基因组脱靶分析方法和体外全基因组脱靶分析方法，已由第1 代测序技术发展到第3 代，目前已经成为分析脱靶效应的主流方法，其中全基因组无偏双链断裂点测序（genomewide，unbiased identification of double strand breaks enabled by sequencing）和基因组环化测序（circularization forinvitroreporting of cleavage effects by sequencing）代表了迄今为止最具可扩展性和易于复制的方法［31］。与传统方法相比，该方法具有更加全面、精准、高效等优势［32］，不足之处在于成本高、产量低，需要复杂的生物信息学知识，且对数据存储和处理有巨大的计算需求。

2.2 基因组DNA的整合位点分析

整合位点分析可精确定位基因组中的插入，为评估纵向修饰基因和移植细胞群的克隆性提供了一种工具，该技术已成为整合载体系统以确定安全性和追踪整合位点的主要基准。最初病毒载体整合位点分析经TaqMan 实时荧光定量PCR 分离扩增，用获得的扩增产物进行分子杂交实验来分析整合位点特征［33］。由于PCR与测序技术的快速发展，操作复杂、灵敏度低的分子杂交技术逐渐被取代，下一代测序（next-generation sequencing）逐渐成为主流的整合位点分析技术。根据PCR技术路线的不同，主要有反向PCR、连接介导型PCR（ligation-mediated-PCR，LM-PCR）和线性扩增介导型PCR（linear amplification mediated-PCR，LAM-PCR）。

2.2.1 反向PCR

反向PCR 技术可对已知DNA 片段相邻的未知序列进行扩增和研究。此方法在分子生物学研究中应用广泛，可检测病毒、转座子等在基因组中的整合位点和克隆基因的邻接序列以及建立基因组步移文库等［34］。首先使用限制性核酸内切酶将宿主DNA打断，然后对病毒载体末端重复序列设计反向引物并进行扩增，从而在连接酶的作用下已知序列（末端重复序列）与整合位点两翼的未知序列形成环状结构，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分析判断其相对分子质量后，可进行TA 克隆（TA cloning）及测序，获得病毒载体整合位点特征［35］。反向PCR的主要优势在于简单快速，但其连接酶成环效率较低，导致使用范围受限。

2.2.2 连接介导型PCR

LM-PCR 主要通过4 个步骤来实现［36］：①模板DNA 的片段化处理；②针对病毒载体末端重复序列设计引物；③模板片段与接头连接；④进行PCR扩增反应。扩增产物通过测序后即可揭示病毒载体整合位点特征。LM-PCR 具有灵敏度较高、使用通用引物扩增均衡、对模板质量要求低和产物产量高等优势，同时也存在操作步骤相对繁琐、面对复杂模板时易丢失片段等缺点［37-39］。使用限制性内切酶对模板DNA进行片段化处理，存在酶切偏好的局限性，因此LM-PCR 的衍生体，即剪切延伸引物标签选择（shearing extension primer tag selection，S-EPTS）/LM-PCR 被开发，其使用超声打断法对模板DNA进行片段化处理，随机打断的的方式克服了酶切的偏好性，使得扩增效果大幅提高［40］。

Cristina 等［41］使用一种介导人CD18 的LV 载体，对白细胞黏附缺陷症Ⅰ型进行基因治疗，并使用S-EPTS/LM-PCR 进行整合位点分析。整合位点分析在Genewerk 实验室（德国）进行，模板DNA用量为500 ng进行扩增，并使用超声剪切仪剪切至中位长度400～500 bp。使用长末端重复序列特异性的生物素化引物对剪切的DNA 进行延伸。扩增产物通过磁珠捕获富集，然后连接到包括分子条形码在内的连接盒上。连接产物经2轮指数PCR扩增后采用MiSeq技术（Illumina平台）进行深度测序，最终在对应的样本中检测到10个最显著的插入位点。

2.2.3 线性扩增介导型PCR

LAM-PCR 与LM-PCR 不同之处在于，在模板DNA 的片段化处理前引入线性扩增，即对目标序列（载体-基因组连接部分）设计特异性引物并进行生物素化标记，通过磁珠固相选择去除非目标DNA序列，保留的目标序列则被进行初始预扩增（100个循环）。该步骤使得LAM-PCR 的灵敏度和特异性大幅提高，是目前识别位于已知DNA 附近的未知DNA 的最敏感方法［42］。LAM-PCR 同样受到酶切偏好的限制。为此开发了一种LAM-PCR 的变体，称为非限制性LAM-PCR，可绕过限制性消化，从而消除整合位点的酶切偏好性，有利于对宿主基因组中的原病毒位置进行全面分析［43］。

Helen 等［44］使用LAM-PCR 对转导整合缺陷LV 的平滑肌细胞DNA 进行扩增。磁珠捕获生物素化的单链线性PCR 产物后，进行了双链DNA 合成。得到的双链片段分别用Tsp509Ⅰ或MseⅠ酶切，连接盒接头连接后进行2轮指数扩增。对所得到的LAM-PCR 扩增产物进行深度测序并使用局部同源性搜索工具（basic local alignment search tool，BLAT）与人类基因组序列进行比对，最终分析了共同插入位点的倾向性。

2.2.4 靶向富集测序

靶向富集测序是一种捕获基因组特定区域DNA 并进行深度测序的方法［45］，其关键在于靶向富集。当前高通量测序的靶向富集方法主要有2种［46］：①杂交捕获法，主要利用探针杂交富集目标片段，适用于基因组目标区域的全面检测，但依赖于成百上千个寡核苷酸探针的设计、复杂的微阵列芯片制造和较长的杂交时间；②多重PCR 扩增法，其核心是引物设计，先通过PCR 扩增富集目标片段，再进行文库构建，适用于研究的目标区域相对较小，对于拷贝数较低的模板DNA，可产生足够数量用于测序的扩增子，这种方法能明显提高效率，节约时间，降低经济成本；不足之处在于存在引物互相干扰和非特异性扩增等问题［45］。CRISPR/Cas9 靶向富集方法的出现弥补了上述2 种靶向富集方法的不足，该方法具有无PCR 扩增、保留碱基修饰信息、实现高测序深度、低错误率和低成本的长读长测序等优点［47］。靶向富集测序在评估病毒载体介导的遗传毒性时，能够捕获和测序载体基因组，并确定载体拷贝数；可以对一个给定的载体进行广泛的验证，对载体基因组进行定量分析，揭示整合位点的整体克隆性并阐明每个细胞和载体基因组拷贝的整合频率。

2.3 核型分析

病毒载体与宿主基因组发生整合，尤其当整合发生在基因组不稳定区域，如卫星DNA 序列、回文序列和CpG 岛，则更容易自发断裂，导致缺失、插入和易位等［48］。因此，精准确定目的基因在宿主染色体上的位置成为重中之重。核型分析技术为检测克隆性异常相关核型及可能的染色体重排提供了可能。传统的染色体核型分析技术是诊断染色体疾病的金标准，但该方法存在诊断周期长、易培养失败、操作过程繁琐复杂、对技术人员要求较高等局限［49］。核型分析对染色体的轻微结构异常不能做出明确诊断，尤其是对具有相似条纹或相似片段的染色体易位的诊断有一定难度；而荧光原位杂交技术可很好克服该局限性，能够分析一部分染色体显带技术不易分辨的异常［50］。光谱染色体自动核型分析技术是在荧光原位杂交技术基础上发展起来的，对染色体结构异常能作出快速而准确的诊断，更可以揭示常规分析方法难以识别的染色体易位、重排和一些未知来源的标记染色体［51］。

2.4 评估细胞转化潜力实验

病毒载体基因组插入到宿主基因组可干扰宿主细胞邻近基因的转录/转录后活性，病毒载体中的启动子或增强子能使癌基因或肿瘤抑制基因表达失调，并引起插入突变导致细胞转化［3］。软琼脂克隆形成实验是研究细胞恶性转化的常用方法，也是体外细胞转化的金标准检测方法，缺点是不适合进行高通量筛选［52-53］。低附着生长实验是一种快速且可定量的细胞转化检测方法，弥补了软琼脂克隆形成实验的不足［54］。此外，还开发了体外永生化法［55-56］，能够检测由于病毒载体插入导致原代小鼠骨髓细胞中原癌基因Evi1表达水平的上调，但耗时较长；还有白细胞介素2 细胞增殖实验［57］和白细胞介素3非依赖性突变体选择法［6］，以及利用Cdkn2a-/-易感肿瘤小鼠模型进行体内实验，以检测病毒载体介导的插入诱变，但这些试验既耗时又昂贵［58-59］。

3 结语

我国国家药品监督管理局颁布的《基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则》中指出，基因治疗产品将遗传物质转移到宿主细胞内或整合到宿主基因组中或对宿主基因组进行编辑，存在潜在的遗传毒性风险。目前对于判断细胞基因组插入/修饰是否会产生遗传毒性、是否最终会发生癌变依然缺乏系统的认知［60］。目前的遗传毒性检测策略在很大程度上依赖于检测相对较短的暴露后对DNA 的影响（损伤或突变）和突变的表达期，但病毒载体介导的插入诱变，可能需要较长时间才能在患者中显现出来。虽然小鼠中常见的整合位点显示与人类癌基因和肿瘤抑制基因有显著重叠［59］，但仍应考虑检测不太常见的插入位点的范围。此外，Bokhoven 等［6］提出病毒载体介导的遗传毒性评估方法需要具备可定量、可再现并能检测基因功能的获得/缺失、确定整合位点等。因此，已有的遗传毒性评价方法需要不断优化，以评估病毒载体介导的遗传毒性。这些优化包括使用受体群体来源的细胞来避免疾病和（或）年龄因素的影响，以及使用可能增强体外模型的体内相关性并支持长期培养的3D 模型［2，7］。同时，在此基础上进行新方法开发与创新。期待能不断拓宽且加深对病毒载体的认识，对其有清晰的、系统的认知，从而经过科学、慎重、严谨的综合考虑，开发通用型的病毒载体介导的遗传毒性评价方法，建立完整的病毒载体介导的遗传毒性评价体系，以用于早期、准确、快速地评价病毒载体介导的遗传毒性。