纳米孔靶向测序在分枝杆菌鉴定和耐药基因检测中的研究进展

杨晨 高卫卫 郭羿成 曾谊

2023年世界卫生组织(WHO)全球结核病报告显示,全球结核病发病率在2020—2022年估计增加了3.9%[1],扭转了过去20年结核病发病率每年下降约2%的趋势。2022年全球估计结核病新发患者例数有1060万例,然而确诊并被报告的结核病患者仅为750万例,一部分患者未能得到及时诊断。同时,2022年全球耐多药/利福平耐药结核病患者估计有41万例,与过去两年的数据相仿。可见,进一步提升结核病和耐药结核病的诊断能力仍旧是迫切需要解决的问题。

目前,涂片镜检、培养、表型药物敏感性试验(phenotypic drug susceptibility testing,pDST)等传统的实验室检测方法,由于耗时长、敏感度低、生物安全水平高等原因[2-3],难以满足疾病早期诊断的需求。分子生物学方法虽能同时兼顾结核病诊断和耐药性判断,但是依旧存在耐药基因位点检测有限等问题,限制其进一步推广应用[4]。因此,临床亟需开发更加便捷、高效、准确的检测技术,满足结核病早期诊断和指导治疗的需求。2023年7月,WHO发布了《应用新一代靶向测序技术检测耐药结核病:快速通告》,对新一代靶向测序技术在耐药结核病诊断中的应用前景给予了高度的重视[5]。纳米孔靶向测序作为一种便捷、高效、准确的基因测序新技术,将为结核病及耐药结核病的早期诊断提供新的技术支持。

纳米孔靶向测序的原理及现状

纳米孔靶向测序是一种新兴的三代测序技术,测序速度较快,可以进行几十甚至上百kb(千碱基序列数)的长读长测序,并实时高效地读取并分析测序数据[6],因此,在结核病、埃博拉疫情等传染病监测、人类基因组学研究等方面具有广泛的应用[7-9]。该技术的检测过程仅需一个MinION纳米孔测序仪即可完成,且机器方便携带。MinION配备的流通池有512个通道,每个通道有4个纳米孔,共计有2048个纳米孔可用于DNA或RNA测序。在每个通道中,纳米孔都被固定在与传感器芯片相连的耐电聚合物膜中,并由特定的集成电路单独控制和测量。在电解质溶液中,施加恒定电压通过纳米孔产生离子电流,就可以利用一个马达蛋白牵引带负电荷的单链DNA或RNA分子通过纳米孔,而不同碱基在易位过程中通过纳米孔引起的不同离子电流变化,会被传感器记录下来,并经由一定的算法获得核苷酸序列,以便能实时、快速进行生物信息学分析[10]。在分枝杆菌鉴定与耐药基因检测中,纳米孔靶向测序可通过特定的捕获技术,对临床标本中结核分枝杆菌/非结核分枝杆菌的核酸及耐药基因进行靶向富集,以获得更多用于检测的数据信息,实现结核病及耐药结核病的早期、快速诊断[11]。

纳米孔靶向测序在分枝杆菌鉴定中的应用

一、纳米孔靶向测序检测结核分枝杆菌

1.呼吸道标本的检测效能:目前关于纳米孔靶向测序诊断疑似肺结核的小样本研究正陆续开展[12-14],结果显示,该技术对痰液和肺泡灌洗液检测的敏感度可达75.9%～94.8%,特异度可达80.8%～97.9%,整体性能明显优于GeneXpert MTB/RIF检测(敏感度:26.4%～62.9%;特异度:97.7%～100.0%)和培养法(敏感度:18.6%～57.8%;特异度:65.4%～100.0%)。不过,目前尚缺乏多中心大样本研究的数据进一步验证纳米孔靶向测序对呼吸道标本的检测效能。

2.低菌载量标本的检测效能:纳米孔靶向测序可通过靶向扩增富集结核分枝杆菌特征性核酸序列,提供更多的数据信息用于检测,旨在为低菌载量的结核病(比如涂片阴性肺结核[15]和肺外结核[16])的临床诊断提供实验室证据[11, 17]。许多研究报告了纳米孔靶向测序在诊断涂阴肺结核患者方面具有较高的阳性检出率,且比其他常用检测方法具有显著优势。Yu等[18]使用纳米孔靶向测序对涂阴肺结核患者的临床标本进行检测,阳性检出率高达91.7%,而经结核分枝杆菌培养的涂片阴性标本的阳性检出率仅为32.6%。闫晓婧等[19]以50例涂阴疑似肺结核患者的肺泡灌洗液为研究样本,发现纳米孔靶向测序的阳性检出率为44.0%,高于Xpert检测(16.0%)和培养法(26.0%)。Yang等[13]对13例结核性胸膜炎患者的胸腔积液标本进行纳米孔靶向测序,检测敏感度为84.6%,比Xpert检测和培养法分别高出69%和77%。不过,目前使用纳米孔靶向测序检测的临床标本主要为痰液、肺泡灌洗液及胸腔积液,有关肺外结核的病理组织学标本的研究比较缺乏,亟需进一步探索纳米孔靶向测序对病理组织学标本的检测效能。

二、纳米孔靶向测序鉴定非结核分枝杆菌

目前,非结核分枝杆菌的阳性分离率在不断上升,非结核分枝杆菌病已逐渐成为值得关注的公共卫生问题。不过,传统的检测方法无法直接对非结核分枝杆菌的亚群亚种进行鉴定,仍需开展进一步的菌种鉴定(如直接同源基因或序列比较法)[20]。而纳米孔靶向测序可以直接对分枝杆菌菌种进行鉴定,实现非结核分枝杆菌的快速诊断与非结核分枝杆菌全基因组构建[11]。Huang等[21]使用纳米孔靶向测序快速并准确诊断了1例海洋分枝杆菌病患者,弥补了非结核分枝杆菌分离培养耗时长且要求复杂、PCR技术无法将其与溃疡分枝杆菌精准区分的缺陷[22],为患者提供了更优的治疗时机。Bouso和Planet[23]通过纳米孔靶向测序在鸟分枝杆菌复合菌群中完成了鸟分枝杆菌亚种的完整环状基因组构建,突破了以往短读长测序可能遗漏非结核分枝杆菌关键基因组特征的局限性[24],为纳米孔靶向测序用于辅助诊断非结核分枝杆菌感染与探索其致病机制提供了重要依据。此外,还有研究认为,可以将纳米孔靶向测序与宏基因组学结合,直接从样本中检测全部核酸,同时提高对病原体感染谱中多种病原体的检测敏感度,为临床诊断混合感染提供可靠的依据[25]。

纳米孔靶向测序在耐药基因检测中的应用

一、纳米孔靶向测序检测耐药基因的技术特色

1.准确识别多种耐药基因:目前,许多分子检测技术(比如Xpert检测[26]和线性探针检测[27])对耐药基因的检测仅限于一个或两个基因,在实际临床应用中有所局限[28],而纳米孔靶向测序可以将多达几十种的耐药基因作为检测靶标,对十余种抗结核药物的敏感性进行判断,包括一些新型抗结核药物(如利奈唑胺、贝达喹啉、氯法齐明等)[29]。国外已有许多研究报道了纳米孔靶向测序在耐药基因检测方面的准确性。Mariner-Llicer 等[30]对结核分枝杆菌临床分离株中的9个耐药相关基因进行纳米孔靶向测序,结果发现与全基因组测序的检测一致性为100%;Tafess 等[31]使用纳米孔靶向测序对结核分枝杆菌的19个耐药相关基因区域进行耐药性检测,结果发现纳米孔靶向测序的平均敏感度和特异度分别为94.8%和98.0%。但是,目前国内有关纳米孔靶向测序在耐药基因检测方面的研究还比较缺乏,仍需进一步探讨。

2.进行长读长测序:由于结核分枝杆菌基因组序列的GC含量高达65%且存在大量基因重复区域,以短读长测序为特点的二代测序技术被认为可能存在较大的检测误差[32]。而纳米孔靶向测序可以对GC重复区、碱基修饰区的识别保持高精确率[33-34],因此,适用于检测具有大量重复区域(如PE_PGRS基因[35])及复杂多样(如pncA基因[36])的耐药基因序列。Bainomugisa等[35]比较了纳米孔靶向测序与二代测序技术对PE_PGRS基因中单核苷酸多样性的检测效能,结果表明,纳米孔靶向测序可以鉴定出88个单核苷酸多态性,相比二代测序技术多发现57个。Liu等[37]通过纳米孔靶向测序发现了35个散在分布于pncA基因上的突变位点,但由于无法进行表型药物敏感性试验[36],纳米孔靶向测序对吡嗪酰胺耐药性的判断仍需谨慎对待。此外,Bainomugisa等[35]使用纳米孔靶向测序对一种广泛耐药的结核分枝杆菌菌株进行研究时,发现了3个二代测序技术过去并未识别到的基因组缺失,从而完善了该耐药菌株所有耐药突变的记录。 不过,由于纳米孔靶向测序在识别单核苷酸突变过程中容易出现测序错误[38],因此,在发现新型(未知)耐药突变时应首先排除测序错误的可能,再谨慎地解释纳米孔靶向测序的检测结果。

3.实时、快速地进行耐药基因检测:由于文库制备过程简单,可直接对DNA或RNA进行检测,节约了操作时间也降低了测序成本,越来越多新的分析软件与测序平台开始支持并推广纳米孔靶向测序在检测耐药基因方面的应用。Tafess等[31]使用基于纳米孔靶向测序的商用测序平台,对163株结核分枝杆菌分离株进行耐药基因检测,达成了与基于二代测序技术的测序平台一致的检测效能,但纳米孔靶向测序平台的整个工作流程仅需15 h,比二代测序平台节省了23 h。Chan等[39]设计了一个可以直接从临床标本中检测结核病耐药性的纳米孔靶向测序平台,整个检测过程仅需6～9 h,远少于培养法+表型药物敏感性试验的平均耗费时间(69.5 d)及二代测序技术的平均耗费时间(46.85 h)。

二、纳米孔靶向测序检测耐药基因的不足之处和改进方法

1.识别单核苷酸突变:纳米孔靶向测序识别单碱基变异的能力较差[40],被认为很可能是由于纳米孔原始数据的高错误率,而测序原始数据错误源于DNA的不均匀易位速度、低信噪比和多个核苷酸同时通过纳米孔[41]。目前,有许多读取优化方法和纠错工具,可以用于提高纳米孔测序数据的准确性和可靠性[42-43]。(1)加入DNA聚合酶。许多研究表明,掺入DNA聚合酶(如Phi29 DNA聚合酶)可以减缓DNA通过纳米孔的异位速度,进而提高纳米孔靶向测序数据质量[44-46];(2)改善马达蛋白/流通池。以在2020年1月发布的最新版R10.3流通池为例,当使用R10.3流通池时,与相同的Sanger序列(一代测序)相比,纳米孔靶向测序的检测准确度可以提高至99.83%,特别是均聚物错误平均减少了57%[47];(3)提高读取深度。有研究建议,可以通过减少MinION部分的测序时间来容许更大的读取深度,使得MinION可以在稍长的测序时间中,从DNA浓度较低的结核分枝杆菌样本中产生更可靠的测序数据[48];(4)开发新式分析算法。无论是Sahlin和Medvedev[49]开发的用于转录组学读数错误校正的IsONcorrect算法,还是Oxford Nanopore公司近期发布的专门用于提高单分子碱基识别准确性的分析算法Bonito CRF[50],都汇报了纳米孔靶向测序经改良后可达到超过98%的准确率;(5)利用文库纠错工具。有研究指出,一种文库适配器CAPTOR可以定量检测文库制备过程中的准确性和偏差,并对基因序列的测序错误进行经验建模,进而协助纳米孔测序数据集的单核苷酸错误的校正和解释[51]。

2.识别异质性耐药:异质性耐药情况指的是患者体内同时分离出敏感菌株和耐药菌株或是不同耐药谱菌群在患者体内共存的现象[52]。由于耐药位点与其他功能位点不一致的突变频率,以及给药治疗过程中患者自身的不确定进展[53-55],耐药基因突变的变化过程往往是动态的,因此,可能出现表型耐药与基因型耐药不相符或是患者在不同时间对治疗药物表现不同耐药情况的结果,这就使得常规检测手段及纳米孔靶向测序很难对异质性耐药群体作出可靠的临床诊断[56]。如何提高纳米孔靶向测序对异质性耐药群体的检测效果,是一个值得关注的方向。有研究提出,可以通过提高纳米孔靶向测序在未经培养标本的测序深度,来减少因培养导致的遗传多样性失真,从而快速准确得到患者的异质性耐药情况[57]。还有研究认为[58-59],加强纳米孔靶向测序在耐药结核病患者表观遗传学领域的研究,以识别DNA不同的甲基化模式对耐药性发展的影响[60],可能有助于解释复杂多样的耐药机制。

总结与展望

纳米孔靶向测序具有便捷高效、长读长测序等优势,在分枝杆菌菌种鉴定、检测高度重复与复杂多样的基因序列,以及发现新型(未知)耐药突变方面发挥关键作用。随着纳米孔靶向测序技术准确率与通量大小的不断改善,未来很可能构建出一个开放和集成的系统,来储存所有类型结核病耐药基因突变以及相应的临床诊疗结果的数据库,以允许基于纳米孔靶向测序技术的全基因组测序能够很快地更新基因突变的预测算法,从而实现更多结核病患者的精准治疗。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献杨晨:起草文章;高卫卫和郭羿成:对文章的知识性内容作批评性审阅;曾谊:对文章的知识性内容作批评性审阅、获取研究经费、行政/技术/材料支持、指导、支持性贡献