细胞焦亡在肾缺血-再灌注损伤中的研究进展

申开文 张瑞波 王 强 岑威虎 沈 俊

肾缺血再灌注损伤是一种常见的临床并发症,缺血导致细胞内三磷酸腺苷减少,细胞膜上钠钾交换功能下降,最终引起细胞水肿及细胞损伤。再灌注后,增加的活性氧(reactive oxygen species,ROS)会导致细胞再次损伤,受损细胞释放的内源性损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMP)刺激机体细胞分泌促炎和趋化细胞因子,进一步加重细胞损伤。缺血和再灌注两个过程均导致肾小管细胞损伤、肾小球滤过率(glomerular filtration rate, GFR)降低,并最终导致急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)[1]。AKI是一种全球常见的疾病,有着较高的发生率和病死率[2]。细胞焦亡作为程序性细胞死亡的一种形式,Gasdermin D(GSDMD)是细胞焦亡的关键效应物,它的主要作用是在胞膜上形成孔隙,最终导致细胞肿胀、膜溶解和炎性细胞因子释放,众多的研究表明,GSDMD介导的细胞焦亡是RIRI的一个重要过程[3]。本文通过总结国内外最新文献论述,对细胞焦亡的发生机制,细胞焦亡在RIRI中的作用及临床应用潜力做一阐述。

一、细胞焦亡定义及其途径

1.细胞焦亡定义:细胞焦亡这个定义最早提出是在2001年,被称作是伴有炎性反应的程序性细胞死亡。在不断对细胞焦亡研究中,目前细胞焦亡的定义是由某些炎性小体触发的依赖GSDMD的一种炎症性程序性细胞死亡形式,具体过程表现为炎性小体使caspase蛋白激活,caspase蛋白激活后可加工和激活IL-1β和 IL-18,同时还切割GSDMD以释放膜孔形成GSDMD-N结构域。GSDMD蛋白的N端结构域在细胞膜上形成孔洞,诱导细胞膜破裂及IL-1β和 IL-18炎性细胞因子释放[4]。

2.细胞焦亡途径

(1)细胞焦亡经典途径:经典途径是指NLRP3等炎性小体通过诱导caspase-1的激活触发细胞焦亡。该途径主要通过DAMP或病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)与模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)的结合而启动,然后PRR可以募集凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和pro-caspase-1以形成炎性小体。这些炎性小体募集并结合到ASC,导致ASC聚焦并激活caspase-1。caspase-1参与pro-IL-18 和pro-IL-1β的切割和成熟,同时切割GSDMD产生N和C末端。GSDMD的N末端片段(GSDMD-NT)释放并在质膜中形成孔隙,导致炎性细胞因子的分泌和水分子流入,产生细胞肿胀和渗透性裂解。最终诱导细胞焦亡和细胞内物质的分泌,释放的细胞因子和DAMP会引发炎症和随后的免疫反应[5]。NLRP3激活后,通过其pyrin结构域,ASC与传感器分子相互作用,胱天蛋白酶募集域蛋白(caspase recruitment domain containing protein,CARD)结构域与pro-caspase-1相互作用,使pro-caspase-1自切割形成caspase-1成熟体。一方面,活化的caspase-1识别无活性的IL-1β和IL-18前体,并将它们转化为成熟的炎性细胞因子。另一方面,caspase-1切割GSDMD并寡聚化介导膜孔形成的31kDa氨基末端产物(GSDMD-N)。膜孔形成,细胞肿胀,炎性细胞因子的释放,最终导致细胞焦亡[6,7]。

(2)细胞焦亡的非经典途径:非经典途径诱导的焦亡是对革兰阴性菌的一种独特的免疫反应。它是由G-细菌表面的脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导产生,激活了caspase-4/5/11,而caspase-4/5/11又激活了一系列下游蛋白,最终在细胞膜上形成蛋白孔,并诱导细胞裂解过程[8]。非典型途径的焦亡是由caspase-4、caspase-5和caspase-11介导。caspase-4/5和caspase-11具有较高的特异性和亲和力,可直接与LPS或脂质A结合激活。GSDMD是炎性caspase的直接底物,而活化的caspase-1/4/5/11是四聚体,可以裂解纯化的重组GSDMD,生成成熟GSDMD的前焦亡N端片段,触发焦亡诱导。caspase-11介导的GSDMD成熟有助于NLRP3依赖性caspase-1激活和IL-1β释放。激活的caspase-4/5/11可反向激活NLRP3炎性小体,促进IL-1β和IL-18的成熟和分泌。研究推测过度激活内质网应激触发的CHOP-caspase-11可能是参与焦亡的重要途径[9]。caspase-11甚至可以在没有LPS刺激的情况下激活非典型NLRP3炎性小体。此外,有证据表明,除GSDMD外,caspase-4/5/11也可作用于通道蛋白Pannexin-1,调节炎性介质的释放[10]。

(3)细胞焦亡的其他途径:除GSDMD外,GSDME是一种新发现的通过caspase-3的裂解产生焦亡GSDME-N的焦亡介质。Hu等[11]研究证明了敲除GSDME基因可抑制细胞焦亡,表明GSDME在此过程中起重要作用。还有研究发现,抑制GSDME可以减轻小鼠的急性肾损伤和炎症,表现为GSDME-N表达下调,IL-1β和LDH释放降低,细胞活力增强[12]。当GSDME高表达时,活性的caspase-3将其切割,释放N端结构域在细胞膜上打孔,导致细胞肿胀、破裂、死亡,发生细胞焦亡。当GSDME的表达水平较低时,就会导致细胞死亡的经典机制,即凋亡[13]。

二、细胞焦亡与RIRI

1.NLRP3与RIRI:炎性小体是一组细胞内蛋白质复合物,包括NLR、ASC、caspase-1,有时还有caspase-11。一旦被激活,炎性小体就会作为触发caspase-1、细胞因子释放而发生细胞焦亡[14]。NLRP3炎性小体在调节肾脏炎症方面的重要作用已在不同的肾脏疾病模型中得到证实。RIRI过程中坏死管状细胞能够通过释放活线粒体激活巨噬细胞中的NLRP3炎性小体。NLRP3缺乏对RIRI后小鼠肾脏炎症和组织损伤具有保护作用[15]。此外,有研究报道,肾脏相关的NLRP3损害影响伤口愈合。管状细胞中NLRP3的缺失可改善再生反应[16]。研究发现,培养的肾近端小管细胞中P2X4嘌呤能受体的激活诱导了NLRP3炎性小体的蛋白质的mRNA和蛋白表达,NLRP3激活后,NLRP3蛋白复合体低聚并形成炎性小体,随后caspase-1被激活,促进炎性细胞因子IL-1β和IL-18的成熟、蛋白水解裂解和分泌,发生细胞焦亡,造成肾功能损伤[17]。Zheng等[18]通过采用RIRI建立AKI小鼠模型,评估了缺血性AKI急性期和慢性期肾脏NLRP3的表达。通过RNA测序,发现严重AKI后肾脏NLRP3信号相关基因上调,CKD活检发现NLRP3在肾小管上皮细胞中升高,说明持续的NLRP3过表达与AKI后的慢性病理改变相关。这些结果提示,NLRP3炎性小体可能是治疗RIRI损伤的潜在靶点。

2.GSDMD与RIRI:GSDMD由一个242个氨基酸的氨基末端结构域组成,通过一个43个氨基酸的接头连接到一个199个氨基酸的羧基末端结构域[19]。研究发现,转录诱导精子形成基因40 (Tisp40)参与了RIRI,研究结果显示,Tisp40过表达加重了细胞焦亡,其机制是增加了GSDMD蛋白的表达,敲除Tisp40可显著降低GSDMD的表达水平,减轻RIRI引起的肾细胞焦亡[3]。此外,GSDMD缺陷小鼠对RIRI诱导的AKI高度敏感,也证明了缺失GSDMD在RIRI中有保护肾小管免受损伤方面作用,其机制是抑制了细胞焦亡[20]。

3.caspase与RIRI:caspase在启动细胞焦亡中起核心作用,它们通常以不活跃的pro形式存在于细胞质中,并被其他caspase的蛋白水解裂解激活。caspase-1在被各种炎性小体激活后引发细胞焦亡,并导致受影响细胞的裂解[21]。RIRI发生6h后,caspase-1、caspase-11和IL-1β的水平显著升高,并在RIRI发生12h后达到峰值,伴随肾脏结构和功能损伤的升高。研究表明,在RIRI细胞实验中,低剂量束尼卡霉素预处理可缓解肾组织损伤。其机制是降低caspase-11活性来实现,证明了caspase是RIRI发生细胞焦亡的重要蛋白[9]。

三、细胞焦亡相关的RIRI治疗靶点

1.PRMT5:蛋白质精氨酸甲基化转移酶5 (protein arginine methylation transferase 5, PRMT5)是负责精氨酸单甲基化和对称二甲基化的主要酶,在广泛的细胞过程中的重要生物学功能[22]。研究表明,抑制PRMT5可以减少RIRI后氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的产生。而RIRI诱导ROS的产生和炎性反应决定了肾脏损伤的严重程度,RIRI诱导的ROS导致炎症相关信号因子如NLRP3的释放,它催化pro-caspase-1转化为活化的caspase-1,随后诱导细胞焦亡。抑制PRMT5对RIRI引起的肾脏损伤具有保护作用,防止肾细胞发生ROS诱导的炎症和焦亡,并促进肾小管细胞增殖。因此,PRMT5可能是一个很有前途的治疗RIRI的靶点[23]。

2.miR-92a-3p:miR-92a-3p是一种非编码的内源性微小RNA,通过靶向信使RNA (mRNA)抑制翻译[24]。研究表明,miR-92a-3p的抑制可缓解体外氧化应激,降低体内外NLRP3、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18的表达水平,其机制是 miR-92a-3p的抑制是通过血红素氧合酶-1 (heme oxygenase-1, HO-1)靶向Nrf1来防止TECs氧化应激和细胞焦亡[25]。可将miR-92a-3p作为RIRI的关键调节因子和潜在的生物学标志物或治疗靶点。

3.柚皮素:柚皮素是膳食柑橘类水果中存在的一种多酚类成分,因其强大的药理活性和良好的治疗前景。在RIRI过程中,柚皮素可减轻肾组织损伤、Cr、BUN和KIM-1水平,其机制是柚皮素可通过激活Nrf2/HO-1信号通路抑制内质网应激,抑制NF-κB信号通路,从而减轻细胞焦亡,从而保护肾脏[26]。

4.青蒿琥酯:青蒿琥酯是由青蒿素提取的半合成化合物,除了抗疟作用外,还具有抗炎的效果。实验研究表明,通过青蒿琥酯预处理过的大鼠,通过免疫组化、免疫荧光、蛋白质免疫印迹法检测NLRP3 炎性小体、caspase-1、GSDMD蛋白及相关炎性细胞因子的表达,结果均低于未使用青蒿琥酯预处理的大鼠,表明青蒿琥酯能在RIRI中发挥抗炎作用。其机制是青蒿琥酯能减少焦亡相关蛋白的表达,抑制细胞焦亡,从而减轻RIRI[27]。

5.表氧化二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids,EET): EET是花生四烯酸代谢而来的一类脂肪酸代谢产物,具有舒张血管内皮、抗炎及抗细胞凋亡等作用。实验研究表明,在RIRI小鼠模型中,使用EET干预后,RIRI+EET组肾功能损害及NLRP3炎性小体、caspase-1、IL-1β等蛋白的表达水平均低于RIRI组,表明EET能够减轻小鼠RIRI,其机制可能是通过抑制NLRP3活化介导的细胞焦亡而产生一定的保护作用[28]。

6.β-羟基丁酸(β-OHB):β-OHB是构成酮体的主要成分,低浓度时可以保护缺血组织损伤。在一项关于β-OHB对RIRI影响的研究中,结果发现,RIRI小鼠在β-OHB处理后能够降低了caspase-1和促炎性细胞因子的表达,其机制是β-OHB阻止了细胞焦亡[29]。因此,β-OHB可通过抗焦亡作用减弱RIRI,可能是临床治疗和预防RIRI的一个靶点。

7.水通道蛋白-2(aquaporin protein-2, AQP2):AQP2在细胞焦亡中具有调节作用,Fan等[30]探讨了AQP2在近端小管细胞中过表达是否可以缓解RIRI相关的细胞焦亡。建立小鼠RIRI模型,对人肾皮质近曲小管上皮细胞进行缺氧-给氧处理。与假手术组比较,缺血再灌注组肾功能明显下降,组织损伤严重,并伴有更多核溶解和坏死。缺血再灌注组Toll样受体4、caspase-1、KIM-1、IL-1β、IL-18表达明显升高。在人肾细胞试验中也观察到类似的结果。过表达AQP2可部分逆转人肾皮质近曲小管上皮细胞缺氧-复氧诱导的细胞损伤、焦亡及分子表达变化。结果表明,AQP2过表达可能减少近端小管细胞焦亡,因此可能是缓解RIRI中细胞焦亡的新靶点。

8. ETS原癌基因1 (ETS1):Juan等[31]对AKI患者的外周血进行了分析,发现AKI患者的NLRP3水平和细胞焦亡水平明显高于正常对照组。此外,LPS处理后肾小管上皮细胞NLRP3水平升高,转录因子ETS原癌基因1 (ETS1)可与NLRP3上游启动子转录位点结合,使NLRP3在肾小管上皮细胞中转活。敲除ETS1后细胞焦亡水平也降低。敲除ETS1可能通过调节NLRP3的转录来减轻肾小管上皮的细胞焦亡,从而缓解AKI。ETS1有望成为治疗AKI的分子靶点。

9.miR-155:Wu等[32]通过建立大鼠RIRI体内及体外模型,检测mRNA表达水平及蛋白表达水平,应用生物信息学分析来预测miR-155靶点,然后通过荧光素酶试验证实。结果发现,RIRI后焦亡相关蛋白caspase-1、caspase-11、IL-1β、IL-18水平明显升高,miR-155在RIRI大鼠肾组织HK2细胞中的表达显著增加。miR-155的上调促进HK2细胞的焦亡。研究还证实,miR-155上调了caspase-1以及促炎细胞因子IL-1β和IL-18的表达,miR-155可能成为RIRI新的治疗靶点。

10.丹酚酸B (SalB):SalB是从丹参中提取的化合物,对小鼠RIRI具有保护作用。Pang等[33]研究发现,SalB可以改善肾脏损伤,降低氧化应激和炎性细胞因子水平。RIRI中,显著上调的NLRP3、caspase-1、GSDMD和IL-1β的表达被SalB有效逆转,其机制可能是SalB通过激活核因子NF-E2相关因子(Nrf2)/NLRP3信号通路抑制细胞焦亡,从而减轻小鼠RIRI。SalB有望成为临床治疗和防治RIRI的新思路。

11.双硫仑:双硫仑是一种众所周知的解酒药,它能够减轻小鼠巨噬细胞的焦亡。研究表明,RIRI可引起小鼠肾功能障碍,并引起肾小管上皮细胞焦亡,双硫仑可改善RIRI后的肾损害,主要通过抑制非经典途径(caspase-11-GSDMD)来减少细胞焦亡[34]。

综上所述,深入研究RIRI的发病机制、探寻新的治疗靶点是RIRI研究的重要方向。细胞焦亡与RIRI的发生关系密切,通过调节细胞焦亡能使肾脏功能得到改善,细胞焦亡调节可能成为RIRI治疗的新靶点,为临床工作提供更有效的诊疗思路。然而细胞焦亡与RIRI具体作用机制及药物疗效的发挥同细胞焦亡的联系还需要进一步深入研究。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。