烟草叶斑病菌Cumuliphoma indica的生物学特性及室内药剂筛选

安宣鲜　桑维钧　张得平　李昊熙　杨江敏　雷雪梅　王五权　杨茂发

关键词：烟草；叶斑病；Cumuliphoma indica；生物学特性；药剂筛选

中图分类号：S435.72 文献标志码：A

烟草（Nicotiana tabacum L.）隶属于茄科烟草属，原产于美洲，是一年生的草本植物，其叶是烟草产品生产中最主要的材料，是世界上种植十分普遍的一种重要经济作物[1-2]。近年来，随着烟草种植制度的改变，气候条件变化，品种单一以及烟草连作障碍等问题的加重，烟草病害流行范围变广，危害程度愈发严重，经济损失也越来越大[3-6]。其中，烟草叶斑类病害是烟草生产上威胁最大的病害之一，在烟草的整个生育期都有发生，可直接导致烟草产量下降，品质降低[7-8]。

2021 年，课题组在广西壮族自治区贺州市发现一种发生在烟草生育中后期，病斑为白色，外周有黄色晕圈的叶斑病，对病原进行了分离鉴定，明确该病原菌为Cumuliphoma indica，此为国内该病原菌在烟草上的首次報道[9]。C. indica 隶属于子囊菌门（ Ascomycota ）、腔菌纲（ Loculoascomycetes）、格孢腔菌目（Pleosporales）、亚隔孢壳科（Didymellaceae）、Cumuliphoma 属[10]。Cumuliphoma是2018 年VALENZUELA-LOPEZ 等建立的新属，其模式种为C. omnivirens，该模式种由基物异名Phoma omnivirens 新组合而来[10]。早在2009 年AVESKAMP 等[11]报道了P. omnivirens 可引起菊科、豆科和白花丹科多种植物病害。2018年，江艳等[12]将在贵州发生的烟草茎点病的病原鉴定为P. omnivirens，其后，商胜华等[13]的研究明确了P. omnivirens 菌丝生长的最适培养基为牛肉膏蛋白胨培养基、燕麦培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基，最适温度为30 ℃，最适pH 为10，最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为硝酸钾和硝酸钙，致死温度为58 ℃，以及发现3%中生菌素对该病原菌菌丝生长的抑制效果最好。

2021 和2022 年对广西壮族自治区主要植烟区烟草真菌性叶斑病害种类的调查发现，该病害在钟山县公安镇、燕塘镇以及富川瑶族自治县朝东镇、石家乡、福利镇、新华乡、柳家乡等乡镇均有发生，田间发病率在30%左右，该病对烟叶生产具有潜在的危害性。目前，关于C. indica生物学特性以及防治方面的研究基本处于空白，亟待进一步研究。本研究通过测定分离菌株的致死温度以及不同培养基、温度、pH、碳氮源、光照周期对菌丝生长的影响，以明确C. indica 的生物学特性，同时探究9 种化学药剂对病原菌生长的抑制作用，旨在为该病害的有效防控提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 2021 年，采用常规组织分离法[14]从15 份广西壮族自治区贺州市钟山县烟草（品种：K326）病叶样品中分离得到2 株C. indica 菌株（编号分别为HZGA75、HZGA79），保存于贵州大学烟草学院植物病理实验室， 选用菌株HZGA75 用于后续试验研究。

1.1.2 供试培养基供试培养基分别为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司）、玉米粉琼脂培养基（CMA，北京索莱宝科技有限公司）、察氏培养基（CDA，北京索莱宝科技有限公司）、燕麦培养基（OA，北京索莱宝科技有限公司）和自配番茄汁琼脂培养基（TomA，自配）、山药汁琼脂培养基（YA，自配）、烟叶汁琼脂培养基（TobA，自配）和水琼脂培养基（WA，自配）。自配培养基配方参照方中达[14]的方法等量配比。

1.1.3 供试药剂本试验所用的杀菌剂种类、厂家及处理浓度详见表1。

1.2 方法

1.2.1 病原菌生物学特性研究（1）不同类型培养基对病原菌菌丝生长的影响。将菌株HZGA75接在PDA 平板上于28 ℃全黑暗培养3 d。采用内径为5 mm 的无菌打孔器在菌落边缘打取菌饼，菌丝面朝下（下同）接种至上述8 种培养基上，每个培养基3 个重复，置于28 ℃恒温培养箱中黑暗培养。培养7 d 后，采用十字交叉法测量菌落直径[15]。下同。

（2）温度对病原菌菌丝生长的影响。将5 mm的菌饼接种在新的PDA 培养基上，分别置于5、10、15、20、25、28、30、35 ℃的恒温培养箱中黑暗培养7 d，每个处理3 次重复[16]。

（3）pH 对病原菌菌丝生长的影响。以PDA为基础培养基，用1% HCl 和1% NaOH 溶液调配培养基的pH 为8 个不同梯度（4、5、6、7、8、9、10、11），将5 mm 菌饼接在培养皿中央，置于恒温培养箱中黑暗培养7 d，每个处理重复3次[17]。

（4）碳、氮源对病原菌菌丝生长的影响。以察氏培养基（CDA）为基础培养基，以不加碳源的察氏培养基为对照，将培养基中的蔗糖用相同含量的葡萄糖、甘露醇、乳糖、肌醇、山梨糖醇和可溶性淀粉替代；同理，以不加氮源的查氏培养基为对照，以等量的蛋白胨、硝酸铵、牛肉浸粉、氯化铵，尿素、甘氨酸、丙氨酸代替培养基中的硝酸钠，将5 mm 菌饼分别接在含不同碳氮源的培养皿上，置于恒温培养箱中黑暗培养7 d，每个处理重复3 次[18]。

（5）光照周期对病原菌菌丝生长的影响。将5 mm 的菌饼接在PDA 培养基中央，分别置于28 ℃恒温培养箱中进行24 h 持续光照、L/D=12 h/12 h 光暗交替和24 h 持续黑暗培养7 d，每个处理重复3 次[19]。

（6）菌丝致死温度测定。将5 mm 的菌饼接入装有1 mL 无菌水的离心管中，分别于40、45、50、55、60、65 ℃的恒温水浴锅中持续处理10 min（提前预热1 min），计时结束后立即置于常温水中冷却至室温，随后将处理的菌饼接种于无菌PDA 培养基中央，于28 ℃恒温培养箱中黑暗培养7 d，每个处理3 次重复[20]。

1.2.2 杀菌剂对病原菌菌丝生长的抑制作用采用菌丝生长速率法测定9 种药剂对菌株HZGA75菌丝生长的抑制效果。经初筛得出各药剂的试验终浓度（表1）。将不同浓度的药剂溶液加入PDA培养基中充分混匀，制作表1 浓度的含药平板，以添加相同体积无菌水的PDA 平板作为对照，每个处理设3 次重复。接菌后将平板置于28 ℃恒温培养箱中黑暗培养，7 d 后用十字交叉法测量菌落直径，计算各药剂不同剂量处理对病原菌菌丝生长的抑制率，并求出各药剂对病原菌的抑制中浓度（EC₅₀）[21]。

抑制率=（对照菌落直径–处理菌落直径）/（对照菌落直径–菌饼直径）×100%。

1.3 数据处理

试验数据使用 Excel 2010 和SPSS Statistics 26软件进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 病原菌的生物学特性

2.1.1 不同类型培养基对病原菌菌丝生长的影响菌株 HZGA75 在8 种供试培养基上均可生長，在CMA、CDA 两种培养基上生长最快，二者间无显著差异，但显著优于其他6 种培养基；在CDA 培养基上培养7 d 后菌落直径达到60.50 mm；在WA培养基上生长最慢，其次是TomA 培养基（图1）。

2.1.2 不同温度对病原菌菌丝生长的影响菌株HZGA75 在10～30 ℃范围内均可生长且差异显著；在5 ℃和35 ℃下菌株菌丝均不生长；在温度为28 ℃时菌丝生长最快，显著高于其他温度处理，培养7 d 后菌落直径分别达到43.83 mm（图2）。因此28 ℃为该病原菌菌丝生长的最适温度。

2.1.3 不同pH 对病原菌菌丝生长的影响。菌株HZGA75 对酸碱度的适应范围广，在pH为4～11范围内均可生长（图3）。在pH 为5 时的菌落直径显著大于其他处理， 培养7 d 后分别达到38.33 mm。在pH 为4 时菌落直径与其他处理有显著差异，培养7 d 后仅达到18.50 mm。

2.1.4 不同碳、氮源对病原菌菌丝生长的影响菌株 HZGA75 在8 种不同的碳、氮源培养基上均可生长。在供试碳源中，菌株HZGA75 对可溶性淀粉的利用效果最佳，培养7 d 后菌落直径达66.33 mm；在以甘露醇为碳源的培养基上菌落直径均明显小于对照，但是对照的菌落菌丝生长极为稀疏（图4）。

在供试氮源中，菌株HZGA75 对蛋白胨的利用效果最佳，其生长速度显著高于其他氮源处理，培养7 d 后菌落直径分别为64.83 mm（图5）。

2.1.5 不同光照周期对病原菌菌丝生长的影响光照处理对病原菌菌丝生长有显著性影响。菌株HZGA75 在持续光照培养条件下生长最快，培养7 d 后菌落直径可达47.16 mm，其次是在光暗交替的条件下；在连续黑暗处理下最慢，培养7 d后菌落直径分别为35.00 mm（图6）。

2.1.6 致死温度测定菌株 HZGA75 在45 ℃处理后菌丝均能生长，在50 ℃处理下则未生长。再以45 ℃为起始温度，1 ℃为梯度进行逐渐升温水浴处理，结果显示经≥49 ℃的温度水浴10 min处理后菌丝在培养基上不再生长，因此推断病原菌菌丝的致死温度为49 ℃水浴10 min。

2.2 杀菌剂对病原菌菌丝生长的抑制作用

由表 2 可知，9 种杀菌剂对菌株HZGA75 菌丝生长表现出不同的抑制作用，其中50%啶酰菌胺WG 的抑制效果最好，EC₅₀为0.025 mg/L；其余依次为50%咯菌腈FS、500 g/L 异菌脲SC、450 g/L 咪鲜胺EW、80%代森锰锌WP、10%苯醚甲环唑ME、25%吡唑醚菌酯SC和40%腈菌唑SC，EC₅₀分别为0.084 mg/L、0.217 mg/L、1.354 mg/L、6.565 mg/L、9.576 mg/L、34.237 mg/L 和38.804 mg/L；430 g/L 戊唑醇SC 的抑制效果较差，EC50 为42.574 mg/L。

3 讨论

Cumuliphoma 是VALENZUELA-LOPEZ 等[10]通过系统发育分析新建立的属，该属真菌可存在于土壤、植物以及人类呼吸道中。目前，有关C. indica引起植物病害方面的报道除本课题组报道的烟草叶部病害外[9]，关于其生物学特性和防治方面的研究未见报道。本研究对已分离鉴定的病原菌菌株HZGA75 进行了生物学特性测定及有效杀菌剂的筛选。其生物学特性研究结果表明，病原菌可在10～30 ℃的温度范围内生长，28 ℃时病原菌菌丝生长最快，菌丝最低致死温度为49 ℃水浴10 min，此结果与VALENZUELA-LOPEZ 等的研究结果存在差异，同时与同属真菌C. omnivirens的生物学特性存在较大差异，导致该差异的原因可能与不同寄主、地域以及物种进化有关。供试菌株对酸碱度的适应性较广，在pH 为4～11 的范围内菌丝均可生长，pH 为5 时病原菌菌丝生长最快，其次是pH 为6，说明弱酸性的环境更适于该菌菌丝生长。供试菌株可利用多种碳、氮源，在供试的8 种碳源和8 种氮源的培养基上均可生长，病原菌最适碳源为可溶性淀粉，最适氮源均为蛋白胨。由于本研究的供试菌株HZGA75 分离自广西壮族自治区贺州市，该地区属于中亚热带季风气候区，具有雨热同季、高温高湿的气候条件[22]，适宜该病原菌的生长。同时贺州市大部分地区土壤偏酸性[23]，且前人研究分离的C. indica 菌株可来自于土壤[11]，推测土壤可作为该病原菌生存的重要场所，在条件适宜的情况下可对烟草叶片进行侵染，该病原菌引起的烟草叶斑病在贺州市烟区存在一定的潜在危害。针对该病原菌引起的病害，在生产上应加强田间管理以及水肥合理管控来预防病害的暴发流行。

现阶段化学防治仍是烟草叶部病害防治中最有效的方法。鉴于C. indica 较难培养产孢，本研究采用菌丝生长速率法测定了9 种化学药剂对病原菌菌丝生长的影响，结果表明50%啶酰菌胺WG 对病原菌菌丝生长的抑制效果最佳，EC₅₀为0.025 mg/L， 其次为50%咯菌腈FS，EC₅₀为0.084 mg/L。已有研究表明啶酰菌胺对烟草生产中出现的赤星病、灰霉病、Didymella segeticola叶斑病、烟叶霉烂病等叶部病害的病原菌均有较好的抑制效果和病害防效[24-27]。为此，在生产上可选用50%啶酰菌胺WG 对C. indica 叶斑病进行防治。