辣椒种质资源PMMoV抗性基因检测与抗性鉴定

陈建分　曹振木　秦于玲　申龙斌　刘维侠　朱丹　吴怡婷　刘子记　王旭

关键词：辣椒；种质资源；PMMoV；分子标记；抗病性鉴定

中图分类号：S436.418 文献标志码：A

辣椒（Capsicum annuum L.）为茄科辣椒属一年生或多年生二倍体作物，是全球重要的蔬菜作物之一。辣椒果实富含类胡萝卜素、蛋白质、维生素C 等多种营养物质，既可直接食用又可用作调味品，辣椒提取物在医药和化工领域也具有广泛应用。据联合国粮食及农业组织（FAO）统计，2019 年全球鲜食辣椒和加工辣椒总种植面积约为3.7190×10⁶hm²，总产量约为4.2283×10⁷t；我国2019 年辣椒种植面积约为8.4700×10⁵hm²，总产量达1.9333×10⁷t，居全球首位[1]。

长期以来，病毒病一直是威胁辣椒生产的重要因素。目前，我国报道的病毒种类有30 余种，近年来辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle viru，PMMoV）已逐渐成为海南[2]、广西[3]、广东[4]、四川[5]、安徽[6]、黑龙江[7]、山东[8-9]、西藏[10]等多个辣椒产区普遍发生的病害。PMMoV 属于烟草花叶病毒属（Tobamovirus），主要通过种传、汁液传播[11-12]。辣椒感染PMMoV 后叶片症状表现轻微皱缩、褪绿斑驳和花叶症状，果实被侵染后表现为扁平、变小、褪绿斑驳、凹凸斑点、畸形与坏死等现象。

L¹、L²、L³、L⁴ 系列等位基因是辣（甜）椒抗烟草花叶病毒属病毒的主要抗性基因[13-15]，这些基因被引入辣椒栽培种中保护植株免受烟草花叶病毒的侵染。目前我国辣椒生产上的PMMoV致病型多以P_1，2株系为主[16-17]，P_1，2致病型病毒株系能够系统侵染带有L¹、L² 抗性基因的辣（甜）椒，而带有L³抗性基因的辣（甜）椒对该病毒株系表现为抗性，L³基因能够应对我国辣椒生产上的主要问题。张宝玺等[18]通过常规育种技术和分子标记相结合，创制出含有抗PMMoV（P_0，1，2）L³基因新品种中椒105 号、中椒106 号、中椒107号、中椒108 号。TOMITA 等[15]通过图位克隆获得L³基因，并利用同位克隆的方法获得了L 的6个等位基因：L¹、L^1a、L^1c、L²、L^b和L⁴。鉴定抗性种质是选育抗病品种不可缺少的步骤，目前，高抗PMMoV 的辣椒种质鲜有报道。由于辣椒的栽培种遗传多样性比较丰富、L 基因组结构较为复杂，目前尚未利用基因序列開发功能标记。因此，本研究利用已报道的L³连锁标记，遗传距离为0.00015 cM，以110 份辣椒种质资源为研究对象，结合抗病基因检测和苗期抗性鉴定，精准筛选抗辣椒轻斑驳病毒的种质资源，以期为选育抗PMMoV 辣椒品种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

参试辣椒种质资源共110 份，材料名称和来源地详见表1。PMMoV 鉴定毒原P1，2 株系由本课题组从田间发病植株上分离提纯保存。

1.2 方法

1.2.1 毒原扩繁及检测 将PMMoV 毒源人工接种在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）上进行扩繁，待发病后选取感病叶片，利用RT-PCR 方法进行分子检测，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表2。

1.2.2 L³抗性基因检测 与L³连锁的分子标记参照TOMITA 等[22]的方法。根据Bioteke DNA 试剂盒（ 北京百泰克生物技术有限公司） 提取gDNA，采用1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计测定DNA 的质量和浓度，并将浓度稀释至100 ng/μL，保存于–20 ℃冰箱备用。PCR 反应体系为20 μL：PCR-mix（2×Es Taq Master Mix）10 μL，模板DNA 1.0 μL，正向引物和反向引物（10 μmol/L）各1 μL，ddH₂O 补齐至20 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，35 个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.3 PMMoV 苗期人工接种抗性鉴定 将筛选出含有抗性基因分子标记的辣椒种质进行苗期人工接种鉴定， 以14SM517m 材料为感病对照（CK–），中椒107 为抗病对照（CK+）。2022年8 月3 日，将所有辣椒种子经10%磷酸三钠溶液浸种35 min，用蒸馏水清洗除去辣味，在55 ℃下温汤浸种4 h，置于28 ℃恒温培养箱中培养。出芽后播种于50 孔塑料穴盘内育苗，每份参试材料3 次重复，每重复15 株。幼苗长至两叶一心期时，移栽至15.2 cm× 15.6 cm 塑料盆中，育苗基质为高温灭菌基质（蛭石∶营养土=1∶2）。

待辣椒幼苗长至4～5 叶期时，取感染PMMoV的烟草新叶，加入10 倍于鲜叶质量的0.01 mol/L 磷酸缓冲液（PBS， pH 7.0）中，在冰上研磨匀浆，离心去渣取上清液，接种液现配现用。在叶面抹薄层600 目金刚砂，用手指蘸取少量接种液轻轻摩擦叶面。接种30 min 后用清水冲去叶面多余汁液，为避免病毒接不上的情况，3 d 后再接种1次。将幼苗置于28 ℃光照培养箱中培养，接种后5 d 调查局部症状，20 d 调查系统症状，计算病情指数，并进行抗性分级。

1.2.4 病情调查与统计 PMMoV 抗性调查的病情指数计算及抗性级别的划分均参考《辣椒种质资源描述规范和数据标准》[23]。

按上述标准划分单株病情级别。0：无任何症状；1：心叶明脉，或接种叶少量急性小枯斑；3：少数叶片呈花叶，或接种叶脱落，茎部产生坏死斑；5：多数叶片花叶，少数叶片畸形，皱缩，或茎部产生坏死条斑；7：多数叶片畸形，皱缩，植株矮化，或茎、枝和叶脉系统坏死；9：植株严重矮化，停止生长；或植株严重系统坏死，甚至死亡。病情指数计算公式为：

病情指数（DI）=Σ（病级数值×该病级株数）/（病级最高值×调查总株数）×100。

品系群体抗病性划分标准：免疫（I），DI=0；高抗（HR），0

1.3 数据处理

试验数据通过Excel 软件进行分析、计算平均值和标准差，使用SPSS 25 软件进行单因素方差分析，采用LSD 或Duncans 法进行多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 毒原扩繁检测结果

RT-PCR 鉴定结果表明，PMMoV 特异性引物能扩增出220 bp 左右的条带，与目的条带一致，而CMV 和TSWV 检测引物均未扩增出条带（图1），初步证明此毒原为PMMoV 单一感染毒原，可用于接种鉴定。

2.2 辣椒种质L³抗性基因检测

L³抗性分子标记鉴定结果表明，17YB32、17SCa28m、CF19-34m、19FB6-1、15SM39-2、CCJ93-1、14SM555×14SM1、14SM567-2、14SM526-1、14SM565-1、14SM514m、14SM502-1、14SM519-1、14SM504m、14SM503m、14SM519-3、14SM518-2、14SM519-2 等46 份种质含有与抗性基因L³连锁的分子标记（图2），其余64 份種质均未扩增出目标条带，说明这些种质不含L³抗性基因。

2.3 辣椒种质PMMoV 抗性鉴定

辣椒种质PMMoV 抗性鉴定结果表明（图3、表3），46 份供试种质存在显著性差异，未发现对PMMoV 免疫的种质，各种质的病情指数在8.86～60.00 之间。病情指数能够反映辣椒种质抗PMMoV 能力的强弱，数值越高，表明抗性越低，反之，表明抗性越高。其中，高抗种质为CF19-34m和19FB6-1，病情指数分别为8.86 和8.79，抗病性显著强于感病种质，叶片几乎无感染症状；抗病种质CCJ93-1 次之，叶片仅有轻微的花叶症状；中抗材料17YB32、17SCa28m、15SM39-2、14SM555×14SM1、14SM567-2、14SM526-1、14SM565-1、14SM502-1、14SM519-1、14SM504m、14SM503m、14SM519-3、14SM518-2、14SM519-2、CCJ52-1 等34 份，植株少数叶片出现花叶、皱缩；感病种质14SM514m、CCJ22-1 、CCJ113-2 、CCJ135-1 、CCJ157-1、CCJ537-1m、L545、CCJ87-2、CCJ133-1，这9 份材料中CCJ113-2 和CCJ135-1 的病情指数最大，病情指数为60.00。感病种质的抗性能力弱，植株叶片多数皱缩和心叶畸形，植株矮化。总体来看，高抗、抗病和中抗材料占总鉴定材料的80.43%。

3 讨论

本研究结合L³抗性基因检测和苗期人工接种抗性鉴定方法，在110 份辣椒种质中筛选出抗PMMoV P_1，2种质37 份，这些抗病种质可为辣椒的抗病育种提供优良的种质资源。近年来，辣椒轻斑驳病毒在国内快速蔓延，研究者正加快筛选对其具较大抗性的辣椒种质。秦蕾等[24]对51 份辣椒种质资源进行了TMV 抗性鉴定，获得抗病材料15 份，其中高抗材料2 份，占总鉴定材料的3.92%；姚明华等[25]对引进的42 份非洲辣椒材料进行了TMV 抗性鉴定，获得抗性材料9 份；王飞等[26]在74 份泰国辣椒种质中筛选出7 份TMV抗性材料。已有研究筛选到的抗性材料相对较少，本研究鉴定结果表明，不同的辣椒种质表现的抗性有所不同，其中多数抗病材料表现为中抗，仅获得2 份高抗材料和1 份抗病材料。这可能是由于抗病性受到多种因素的影响，包括外在的环境因子、内在基因表达及辣椒与病毒的相互作用等。其次，可能高效L 基因主要存在于辣椒野生种当中。

目前，辣椒抗PMMoV 的 L 基因已被克隆。本研究利用已报道的与L³连锁的分子标记对110份辣椒种质进行分子鉴定，结果显示有46 份种质含有抗性分子标记，包括一年生辣椒栽培种（C.annuum L）和中国辣椒栽培种（C. chinense Jacquin）。在接种PMMoV P_1，2菌株后，其中有9 份含有抗性分子标记的种质表现为感病，这种现象可能与品种的遗传背景有关。本研究采用的是与L³连锁的标记而不是功能标记，因此存在假阳性的可能，为了准确鉴定辣椒种质对PMMoV 的抗性，需要结合抗性鉴定结果进行综合判断。

病毒病一直是威胁辣椒生产的主要病害，对辣椒生产造成严重的经济损失[27]。由于PMMoV具有种传的特性，使用化学杀菌剂和传统的农业防治措施无法控制病毒病的为害。与传统育种方式相比，利用分子标记技术可以快速对已知抗性基因进行检测，缩短了育种年限，有利于寻找新抗源，拓宽辣椒品种抗性遗传多样性，对PMMoV抗病品种的选育尤为重要。

本课题组前期研究已经明确了海南儋州辣椒种质资源圃感染的PMMoV 为P_1，2致病型，应用L³抗性基因可以有效克服PMMoV P_1，2 致病型的为害。然而，病毒毒株会克服抗性基因而变异，L³基因对PMMoV P_{1，2，3，4}致病型不具有抗性[28]。因此，未来的工作需要挖掘鉴定其他PMMoV 抗性基因用于辣椒抗性种质资源的创制，为辣椒抗PMMoV 育种提供更高效的抗源材料。