肝虚证动物模型构建现状*

赵 颖 高 翔

1.湖北中医药大学中医学院 (湖北 武汉, 430061) 2.湖北中医药大学附属湖北省中医院肝病研究所 3.湖北省中医院肝病科 4.湖北省中医药研究院中医基础理论研究所 5.中医肝肾研究及应用湖北省重点实验室

古代医家就肝病有无补法存在着不同看法,明代医家刘纯在《医经小学·卷之四》提出“肝为相火,有泻无补”[1]。许文忠[2]分析《名医类案》《续名医类案》8 000余医案,未见补肝阳、少见补肝气。随着清代和近现代医家对中医理论的辨析,以及当代中医药现代化进程的深入推进,学界对肝虚证的认识已大为不同,从气、血、阴、阳论治肝虚证的理论探讨、临床及实验研究也日渐丰富。在中医现代化进程中,证候动物模型的创制成为一项关键工作,中医证候动物模型对于中医证本质研究、中药复方及中药制剂的药效和药理学研究等工作都具有重要意义。本文总结近年来肝虚证动物模型构建现状,以期为建立更符合中医理论及临床实际的肝虚证动物模型提供思路。

1 阴虚证动物模型

“肝体阴用阳”是历代医家在阴阳学说基础上结合临床辨治经验归纳总结出的生理病理特点,肝阴和肝血是肝生理活动的物质基础,故“体阴”;生理功能表现为肝阳和肝气,故“用阳”[3]。丹溪学派的中心学术思想是“阳有余阴不足论”,即“人受天地之气以生,天之阳气为气,地之阴气为血,故阳常有余,阴常不足,气常有余,血常不足”[4]。古代医家曾提出“肝为五脏之贼”,经方大家岳美中先生也曾有“临床所见杂病之中,肝病十居六七”之说,肝阴虚证是临床多种病症常见证候,不独见于中医肝病和现代医学肝胆病。肝虚证病机在于多种原因引起津液、营血、阴精耗损,不能荣养脏腑经络,子盗母气、累及肾脏则出现肝肾阴虚证。同时,津液、营血、阴精同源化生,阴虚、血虚、精虚可相互转化、兼夹,肝阴虚可致肝血虚或精血亏虚,血虚日久也可导致肝阴虚。因此,研究者根据“体阴”的生理病理特点,创建了肝阴虚证、肝肾阴虚证、肝血虚证、肝肾精血亏虚等动物模型。

付晓伶等[5]通过分析1991年至2003年46篇动物阴虚证模型相关文献,将阴虚模型制备归纳为甲状腺激素类(单用、联合利血平或联合其他药物)造模、肾上腺皮质激素(常用氢化可的松)造模、超负荷运动(游泳或联合番泻叶)造模、长期激怒法造模、手术(狭窄左肾动脉)造模、特殊环境(湿热人工气候室)造模、高盐饮食造模、化学性肝损伤联合温燥性中药造模、大肠杆菌内毒素造模。但是46篇阴虚证模型文献中报道的脏腑定位并不统一,大多为肾阴虚;同时也存在同样造模方法被不同研究者分别归结为肾阳虚、肾阴虚。文献中仅欧阳取长[6]采用化学性肝损伤联合温燥性中药造模后认为其模型为肝阴虚证大鼠,方法为40%四氯化碳(CCl4)花生油0.3 ml/100 g皮下注射2次/周,5周后改为1次/周,同时第5、6周联合附子、肉桂、干姜复方(1∶1∶1,生药18 g/kg/d)灌胃1次/d。余下研究中,除任小巧等[7]、樊蔚虹等[8]以长期激怒法造模,并认为模型属于大鼠肝肾阴虚证模型外,其他研究者或将模型归属于肾阴虚证,或未言明脏腑定位。

1.1 肝阴虚证动物模型 近10年以来,文献报道的肝阴虚证动物模型均采用化学性肝损伤联合其他药物或情志刺激建立。

黄雪柠[9]采用CCl4橄榄油溶液联合甲状腺片混悬液制备肝阴虚模型,分别给予实验小鼠20%、10%、5% CCl4橄榄油溶液腹腔注射和甲状腺片混悬液灌胃以确定CCl4最佳剂量,并通过血清、肝脏代谢物多元统计分析鉴定肝阴虚潜在生物标记物。研究发现,CCl4最佳剂量为20%;模型小鼠血清ALT、AST、环磷酸腺苷(cAMP)、cAMP/环磷酸鸟苷(cGMP)比值、TNF-α、IL-6显著升高,IL-10降低,cGMP、SOD显著降低;肝阴虚潜在生物标记物包括252个血清差异代谢物和229个肝脏差异代谢物,涉及核苷酸代谢、嘌呤代谢、类固醇激素生物合成、嘧啶代谢、初级胆汁酸生物合成、花生四烯酸代谢等代谢等通路。李丽等[10]、高晶等[11]采用腹腔注射20% CCl4橄榄油溶液联合甲状腺片灌胃制备肝阴虚证大鼠模型,通过测量大鼠体质量、肛温、舌面干湿度、摄食量、摄水量,观察动物易激惹程度、毛发光泽度、小便颜色、大便颜色及质地等指标并进行评分,综合评定肝阴虚证模型大鼠证候表征。研究发现,模型大鼠体质量降低、肛温升高、24 h摄食量增加,白芍总苷、白芍多糖能够调节环核苷酸含量、雌二醇(E2)和皮质类固醇水平以及能量代谢,研究者认为这在一定程度上揭示了白芍养肝阴的科学内涵[11]。

贾岚等[12,13]采用文献[6]慢性肝损伤联合温燥性中药造模方法复制大鼠肝阴虚证模型,以大鼠体质量、易激惹程度、毛发光泽度、小便颜色、大便颜色质地、肛温等作为肝阴虚证候指标,研究发现白芍多糖能够改善模型大鼠大便干燥程度,白芍总苷能够明显改善模型大鼠体征评分、显著提高大鼠体质量。研究者认为,白芍总苷抗炎、减轻微循环障碍、调节细胞因子IL-6和IL-10平衡可能是白芍养肝阴的物质基础[13]。

贾岚等[14]采用Lieber-DeCarli酒精液体饲料加甲状腺激素灌胃制备小鼠酒精性肝损伤肝阴虚证模型,模型小鼠体重明显减轻、体温升高、心率加快、毛发无光泽,出现疲倦易困、烦躁易怒等肝阴虚证候。白芍水提液灌胃(4.3 g/kg)能够改善模型小鼠肝功能、降低肝组织脂质占比、改善肝细胞坏死程度,疗效机制可能与调节cAMP/cGMP水平及细胞因子水平、恢复肝细胞功能与代谢平衡、增强肝脏乙醇代谢关键酶及抗氧化酶活性、抑制脂质过氧化反应、减少脂质沉积有关。

1.2 肝肾阴虚动物模型 肝肾阴虚证是临床常见中医证型,研究者开展了多种疾病肝肾阴虚证模型的建立和研究工作。

任小巧等[7]以慢性激怒应激法制造大鼠肝肾阴虚证模型,发现肝肾阴虚证大鼠促甲状腺激素释放激素分泌增加,垂体、血清促甲状腺激素降低,血清游离甲状腺素降低而反三碘甲状腺原氨酸增高,加味一贯煎能够影响模型大鼠下丘脑-垂体-甲状腺轴,改善上述指标。樊蔚虹等[8]进行了长期激怒法与化学药物法、温燥药法所制造肝肾阴虚模型进行对比研究,发现长期激怒法大鼠体重增长缓慢,饮水量、尿量减少而体温相对恒定,血浆cAMP下降,E2与睾酮(T)比值升高。研究者提出,长期激怒法所造模型无人为所致内分泌紊乱,更接近临床实际,是肝肾阴虚证的最佳造模方法。

俸道荣等[15]模拟高脂血症及中医肝肾阴虚证的病因,采用高脂饮食联合长期激怒建立高脂血症大鼠肝肾阴虚证动物模型。模型大鼠出现明显消瘦、活动减少、竖毛少泽、食欲减少、弓背、扎堆等现象,血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白-胆固醇显著升高,血浆cAMP含量升高、E2和E2/T比值显著升高。研究者认为该模型大鼠表现出高脂血症肝肾阴虚证的症状、体征,实验室检测指标符合临床实际。刘文兰等[16]采用100% CCl4腹腔注射1次联合长期激怒法建立急性肝损伤肝肾阴虚证病证结合大鼠模型,并从一般状态、饮水量、进食量、游泳时间、肛温、唾液酸碱度、体重减轻、肝脏系数、肝功能、肝脏形态、肝组织病理等方面对模型进行评价,发现该模型具有形体消瘦等阴虚证典型特征,同时具备肝损伤显著、抗疲劳能力降低等肝的定位症状和虚损、尿液异常等肾的定位症状,研究者认为该模型是理想的肝肾阴虚证病证结合动物模型。黄志强等[17]采用左甲状腺素钠灌胃(150 μg/kg)联合夹尾法情志刺激建立肝肾阴虚证候小鼠模型,模型小鼠出现体质量减轻、大便干硬、小便发黄、自主活动增加、易激惹、反应活跃、喜冷怕热等虚热症状。

吴智春等[18]利用晚期自发性高血压大鼠(SHR),根据大鼠辨证方法学将四诊信息转化为具有同等意义的一般行为学指标,认为SHR大鼠午后肛温较高、舌色偏红、前爪抓握能力及肌力较差、学习记忆能力减退、血清T水平偏低及E2/T比值较高等特征基本符合肝肾阴虚证的表现,提出晚期SHR属于肝肾阴虚证候。

艾浩等[19]采用腹腔注射化疗药顺铂(CDDP,3 mg/kg)建立卵巢功能早衰肝肾阴虚证小鼠模型,发现腹腔注射CDDP后小鼠体重减轻,进食、饮水均减少,尿量减少,体温升高,血浆cAMP含量升高;血清E2和孕酮水平降低,促卵泡生成激素和黄体生成素水平升高,卵巢排卵功能明显受到抑制。研究者认为模型小鼠生物学行为接近于临床实际,内分泌功能和生化指标变化特征与临床相似,是系统研究卵巢功能早衰肝肾阴虚证的适宜造模方法。

1.3 肝血虚证动物模型 血虚证动物模型多以化学药物诱发溶血或减少血容量的方式建立,但现有研究均未谈及脏腑定位,肝血虚证研究报告均为临床研究,脏腑定位为肝的血虚证动物模型报道极少。

贲长恩等[20]早在1981年开展了乙酰基苯肼(APH)诱导血虚动物模型的实验研究,探讨皮下注射与腹腔注射对模型大鼠溶血和自然恢复情况的影响,由此开创了化学药物诱导血虚动物模型的实验方法。近年来,研究者在化学药物的选择、给药剂量和方式上开展实验研究,张文卓等[21]、李朝政等[22]、冯伟科等[23]采用APH/环磷酰胺(CTX)复合因素建立血虚证动物模型,李浩等[24]、张小勇等[25]采用CTX诱导血虚证,任德旺等[26]采用腹腔注射盐酸苯肼建立了小鼠血虚证模型。钱宏梁等[27]复制APH诱导血虚证小鼠模型探讨血虚证模型小鼠的证候物质基础,发现模型小鼠呈现虚弱征象,脾脏代偿性增大、胸腺明显萎缩,血液红细胞形态异常、正常红细胞数量减少、白细胞代偿性增多,骨髓成熟的环状核细胞减少,血清皮质酮含量明显升高;脾脏肿大、肾脏Epo基因代偿性高表达以及继发肾上腺皮质功能虚性亢奋是该证候最突出的特征。

王平等[28]首次采用较长时间放血与饥饿相结合的方法建立了家兔血虚模型,通过血液流变学和微循环、心钠素等指标结合补血中药疗效判定,该模型是一种简便、客观、定量、可重复的血虚证模型。许安萍等[29]、徐敏等[30]、王心怡等[31]均采用上述方法复制家兔血虚证模型进行针刺疗效研究,王伟等[32]、肖敏佳等[33]参考上述方法建立了大鼠血虚证模型进行针刺疗效研究,研究者均利用外周血象指标进行疗效评价。郭平等[34]采用3.5 Gy60Co源γ射线全身一次性照射制备小鼠血虚证模型,以骨髓集落培养计数粒细胞-巨噬细胞集落形成单位、红细胞集落形成单位、爆裂型红细胞集落形成单位、混合集落形成单位作为血虚证模型小鼠疗效评价指标。

林腊梅[35]报道了肝切除联合睡眠剥夺建立的肝血虚失眠模型,模型大鼠表现为精神萎靡,易受惊,活动量少,目光呆滞,双目、口唇呈苍白色,皮毛重度枯槁蓬乱、呈黄色,爪甲粗糙,抓取时无力反抗;中枢神经系统神经递质异常,下丘脑、脑干内5-羟色胺和γ-氨基丁酸含量降低,多巴胺、去甲肾上腺素和谷氨酸含量升高。李瀚旻等[36]采用乳鼠皮下注射左旋谷氨酸单钠联合70%肝脏切除建立肝肾精血亏虚大鼠,模型大鼠肝再生度、肝细胞分裂指数、肝重/体重比值、骨髓有核细胞增生度、外周血红细胞计数和血红蛋白均显著下降,给予左归丸补益肝肾精血则上述指标显著改善,研究结果表明肝再生能力可作为观察肝肾精血亏虚证的客观化指标。

2 阳虚证动物模型

明代及金元时期多有医家认为肝无气虚、阳虚之证,但早在《灵枢·本神》有云:“肝气虚则恐,实则怒”,肝气虚证与情志密切关联。气属阳,肝气亏虚、虚损严重则进展为肝阳虚。肝气虚是指肝气升发之力不足,温煦、调畅之力下降所引起的一系列证候表现,而肝阳虚则是在肝气虚的病理基础上发生肝阳渐衰之证,历代医典中已收录并阐述其证候表现及治法[37]。然而,受丹溪学派影响,宋金元时期之后医家鲜少提及肝气虚、肝阳虚,并提出“肝常有余”、“肝无补法”等说法。直至清代、近代,补肝法重新涵盖补肝气、补肝阳,张锡纯在医案中明确记载肝气虚证,提出“补肝气非黄芪不能”的观点[38]。

肝阳虚证、气虚证动物模型研究极少,仅见包祖晓等[39]报道联合应用利血平注射液腹腔注射与氢化可的松注射液肌肉注射建立肝肾阳虚型抑郁大鼠模型,观测大鼠体重、摄食量、饮水量、抓力、敞箱水平穿越数和垂直运动次数、腋温等,以体重、糖水摄入量、血清cAMP含量、cAMP/cGMP比值等作为肝肾阳虚证量化指标。采用图像处理软件选取爪、尾照片特定区域提取色度R、G、B,根据公式r=R/(R+G+B)计算r值以进行计量化辨证,评估模型大鼠阳热、气虚、阴虚和血虚程度。研究者依据利血平药性为寒凉、归肝经的理论探讨[40],以及小鼠皮下注射后出现体重逐渐减轻、活动减少、畏寒、拱背、便溏等阳虚症状的研究报告[41],提出利用利血平所制作的动物模型属肝阳虚。

综上所述,肝虚证动物模型构建和研究工作均有待进一步推进和完善。内经描述了五脏之中肝的位置、大小,与现代解剖学之肝脏基本一致,而肝体、肝用之说则反映了气、血、阴、阳等物质基础是发挥生理功能的载体。因此,借助现代生物医药研究技术构建中医证候动物模型,以解剖学肝脏作为肝藏象物质基础研究的切入点,阐释气、血、阴、阳等物质基础的生物学本质及其承载“肝用”的科学内涵,对于推动中医药现代化进程具有积极意义。