淫羊藿中山柰酚防治骨质疏松症的机制的研究进展

郝庆飞 袁普卫 孟庆豪 赵怡凡 刘德玉 王占魁 余红超

1.陕西中医药大学研究生院，陕西咸阳 712000；2.陕西中医药大学附属医院骨病科，陕西咸阳 712000

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种以骨量减少、随着年龄增长而骨折风险增加的骨骼系统疾病。随着人口老龄化发展，2018 年国家卫生健康委员会调查显示，我国＞65 岁的患者OP 患病率高达32.0%，且每年稳定逐步上升[1]。严重影响患者生活水平，已成为世界首要的公共卫生问题之一。目前临床上治疗OP 采用双膦酸盐、激素代替疗法和降钙素等药物治疗。虽然疗效显著，但副作用大，严重降低患者生活质量[2]。祖国医学中将OP 归为“骨痿”，又名“肾痿”“骨痹”等。中医认为OP 的病因病机大多因肾精亏虚所致。淫羊藿具有补肾壮阳、祛风除湿、强筋健骨等功效，可有效治疗OP，且副作用小[3]。

山柰酚（kaempferol，KAE）是生物类黄酮，广泛存在于水果、蔬菜和中草药中。有研究发现，淫羊藿中活性成分KAE 能有效地促进成骨细胞（osteoblast，OB）分化，抑制破骨细胞（osteoclast，OC）分化，保护骨密度（bone mineral density，BMD），或许其可成为治疗OP 的潜在药物[4]。因此，本文对近年来KAE在细胞、炎症因子、信号通路等方面对OP 的影响进行综述，为临床上OP 的治疗提供新的思路。

1 KAE 防治OP 细胞水平的研究

1.1 KAE 对OB 的作用

OB 是骨修复的重要细胞，在骨修复过程中OB 大量增殖分化，作用到修复部位，再经信号传导分泌骨基质，引起基质矿化，从而提高BMD[5]。碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）是由OB 分泌和合成的蛋白，是OB 成熟分化的主要标志。Xie等[6]研究证明，KAE 通过p53 抑制糖皮质激素受体，改善地塞米松在MC3T3-E1 细胞中的作用，且呈剂量依赖性地提高ALP 活性，提示KAE 可以通过调控激素水平来调节OB 的形成，提高BMD。戴燚等[7]发现，KAE 通过Wnt/β-catenin 信号通路促进β-catenin、Wnt 蛋白表达，提高细胞内ALP、前列腺素E2、一氧化氮的含量，同时调节骨保护素重组蛋白与核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）受体激活蛋白配体（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）的表达水平，从而防治OP。说明KAE可能通过提高ALP，从而提高骨钙素水平，影响骨代谢。以上研究表明，KAE 可能通过调控下游因子和信号通路的表达提高ALP 的活性，提高骨钙素水平，从而刺激成骨细胞分化，预防骨质疏松。因此更深入地研究KAE 对ALP 的调控机制具有重大临床意义，还需要进一步探索讨论。

1.2 KAE 对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC）的影响

BMMSC 是一群非造血的骨髓基质细胞，可增加成骨细胞中骨基因的含量，促进骨的形成[8]。有研究发现，BMMSC 可以促进促分裂原活化的蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信号通路中的相关蛋白的表达，从而抑制BMMSC 分化为成脂细胞来改善OP[9]。王文丽等[10]发现，KAE 呈剂量依赖性提高BMMSC 向成骨分化，同时发现ALP 的活性也呈浓度依赖性提高。说明KAE 可能通过ALP 的活性提高BMMSC 的分化对防治OP 有重大的临床指导意义。崔琳娜[11]通过动物实验发现，KAE 可通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）信号通路提高RUNX 和Osterix 相关蛋白的表达，促进BMMSC 向成骨细胞转化。表明mTORC1 信号通路参与KAE 诱导BMMSC 的成骨潜力。综上所述，可推测KAE 能通过提高MAPK 和MTORC1 通路中相关蛋白的表达，提高ALP 活性，促进BMMSC 向成骨细胞分化，并抑制BMMSC 分化为成脂细胞，减少OB 凋亡，提高BMD 水平。MTORC1 和MAPK 可能会成为治疗骨质疏松的潜在通路，但尚需实验支撑。

1.3 KAE 对OC 的作用

OC 是由巨噬细胞增殖分化而来的一种具有骨吸收功能的多核细胞，是主要的骨吸收细胞，在人体骨骼发育中的作用至关重要。OC 中含有参与骨吸收过程的水解酶-抗酒石酸盐酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP），是OC 分化的主要标志。阿吾提·卡斯木[12]发现，KAE 可以呈剂量依赖性抑制TRAP 的活性，同时发现KAE 可以提高MAPK 信号通路使MC3T3-E1 细胞增加。因此KAE 可以通过调控下游因子促进OB 增殖抑制OC 分化，从而防治OP，但其最优剂量还不确定。Kim 等[13]通过TRAP 染色发现，KAE 能抑制小鼠巨噬细胞自噬并通过降解p62/SQSTM1 促进OC 分化，表明KAE 可能通过调控细胞自噬来抑制P62/SQSTM1 的表达，调控OC。说明p62/SQSTM1 蛋白可能作为KAE 治疗OP 的靶点。Akbar 等[14]研究发现，KAE 可抑制RANKL/RANK 信号通路的激活与表达，抑制OC 的分化与成熟，调节骨代谢平衡。综上所述，KAE对OC 的作用可能是通过抑制细胞自噬、诱导OC 凋亡、调控RAN KL/ RANK/MAPK 等下游信号通路预防骨质疏松。但关于OC 的自噬与凋亡机制十分复杂，仍需进一步研究。

2 KAE 通过调节炎症细胞因子对OP 的影响

2.1 促炎性细胞因子Jun

Jun是一种促炎性细胞因子，与FOS 一起形成AP-1 的二聚体复合物，通过多种机制促进骨生长发育相关基因的转录和表达，从而调节骨代谢[15]。张泉龙等[16]发现，淫羊藿能够能提高下丘脑FoxO1 蛋白的活性，抑制AP-1 活性，从而降低破骨细胞分化水平，并改善BMD、骨小梁参数。因此推断淫羊藿抗OP 机制可能与AP-1 活性有关。Behl 等[17]发现KAE 通过抑制c-Jun N 末端激酶发挥抗氧化、抗炎作用，抑制OC 的形成。因此推断KAE 通过下丘脑抑制Jun 的表达，减少炎症反应，提高交感神经兴奋，从内分泌途径改善骨代谢，来抑制OC 的形成，从而抑制OP 的发生与进展。因此研究KAE 对炎症因子的影响对抗OP 有重大意义，细胞抗氧化机制有可能成为防治OP的重要环节，但其具体机制还需进一步研究。

2.2 肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）

氧化应激反应可以刺激OC 的成熟和分化导致OP[18]。TNF-α 通过调节氧化应激反应，在OP 中起着维持骨量和重塑骨质的重要作用，TNF 还可通过激活NF-κB 通路、促进RANKL、抑制OC 分化和增加骨吸收来影响OP[19]。Palacz-Wrobel 等[20]通过细胞培养发现，30 μmol/L 的KAE 可降低TNF 的表达，并且通过增加抗炎细胞因子白细胞介素（interleukin，IL）-6 的分泌来降低炎症强度。鉴于TNF 在OC 中的作用说明KAE 可能通过减轻炎症反应来维持骨代谢平衡。Wang 等[21]利用网络药理学分析发现，淫羊藿等中草药中KAE 等有效成分能降低大鼠血清中IL-6 和TNF-α 水平，使BMD 指数明显提高，且实验组中骨形态生成蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）、Runt 相关转录因子2（Runt related transcription factor 2，Runx2）表达显著升高，从而促进OB 活性。说明KAE 抗OP 的机制可能与BMP-2、Runx2 信号通路有关。综上所述，KAE 能刺激BMP-2、Runx2 信号通路，降低IL-6 和TNF-α 表达，抑制炎症反应来刺激OB 成熟，防止骨结构的破坏，维持骨代谢平衡。

2.3 IL 因子

IL-6、IL-8 等是参与骨关节病生理学的主要促炎性细胞因子。有研究发现，IL-8 可以通过刺激OB 的BMMSC 表达从而刺激成软骨细胞成熟分化，其钙化后再重塑成骨，增强BMP2 的骨诱导性，从而抑制OC 分化[22]。Lee 等[23]研究证明，KAE 可以调节IL-1β 水平，抑制RANKL 介导的细胞外调节蛋白酶和重组蛋白激酶磷酸化，以及c-Fos 和NFATc1 的表达，从而抑制OC 分化与成熟。综上所述，KAE 可以通过抑制IL，发挥抗炎作用，刺激BMMSC 表达激活BMP2 信号通路，从而促进OB，抑制OC，预示IL 在防治OP 发生的治疗中具有巨大的发展前景。

3 KAE 防治OP 相关通路的研究

3.1 核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路

NF-κB 信号通路在OC 的形成中起着非常重要的作用。NF-κB 信号通路受到RANKL 细胞因子和相关蛋白的严格调控，最终诱导OC 的形成和分化[24]。Zhu 等[25]通过研究发现，KAE 呈剂量依赖性提高骨标志物水平。同时发现KAE 通过NF-κB 信号通路来降低IL-10 的释放和增加IL-6 的释放来缓解炎症，同时发现KAE 可以抑制BMMSC 的成脂分化。鉴于BMMSC 的作用，KAE 可以通过NF-κB 信号通路抑制OC。Li等[26]发现，有效成分KAE 可呈剂量依赖性抑制NF-κB 通路及下游因子TRAP 活性，从而抑制OC 的生成。综上所述，KAE 可以抑制NF-κB 信号通路，减少炎症反应，从而预防OP。NF-κB信号通路可能会作为抗OP 的重要靶点，但其机制复杂，还需要大量的研究证明。

3.2 雌激素受体（estrogen receptor，ER）信号通路

ER 主要是刺激成骨细胞分泌胶原酶，促进骨重建，抑制OC活性，减少骨吸收[27]。Guo 等[28]发现，50 μmol/L 浓度KAE 可呈浓度依赖性提高ER 转录活性来促进OB 分化与成熟。同时发现，经KAE 诱导大鼠OB 的ALP 活性增加。鉴于ALP 在OB 中的作用，可以得出KAE 通过刺激ER 信号传导作用，使得成骨分化，但其最优剂量还需进一步完善。Sharma 等[29]发现，KAE通过刺激ER 信号传导激活Wnt/β-catenin 信号通路，发现OB细胞中ALP、Runx2 等活性增强。说明KAE 可作用于ER，促进OB 的分化，减少骨量，抑制OC，使得OB、OC 达到动态平衡，从而抑制OP。因此，KAE 可以成为雌激素代替疗法的中药治疗药物，但其涉及的信号通路较多，其具体机制有待进一步研究。

3.3 KAE 参与激活发生蛋白BMP/Smads 信号通路

骨形态转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和BMP2 对促进骨折愈合和骨再生发挥着巨大的作用，在临床上可用于治疗OP 患者[30]。有研究发现在TGF-β 通路中，Smad 受体与TGF-β 结合，促进Smad 的C 端磷酸化，形成复合物并转位到细胞核中，从而促进OB，抑制OC；在BMP 信号传导过程中，磷酸化的R-Smad 受体可调节Runx2 的表达，再经过BMP-Smad 信号传导从而参与OB 分化和骨形成[31]。说明Smads 参与TGF-β 和BMP 通路的调节，同时刺激成骨细胞分化，因此研究TGF-β 通路和BMP2 通路对预防OP 有指导意义。Kim 等[32]发现，KAE 处理后的MC3T3-E1 细胞呈剂量依赖性增长，并发现ALP、Runx2、BMP-2 的活性也显著增加。说明KAE 可以通过Runx2、BMP-2 信号通路，增加ALP 活性，促进OB 分化。综上所述，KAE 可以通过BMP/TGF-β 信号传导，使OB 和OC 达到动态平衡，从而治疗OP。因此，在研究防治OP的药物机制时，通过抑制OC 的同时促进OB 将会是未来研究的热点。

3.4 转录因子Runx2 相关通路

Runx2 是一种刺激成骨作用的基本转录因子，有研究发现，通过转录激活剂刺激Runx2 的活性来调节BMMSC 的OB和成脂细胞分化[33]。赵晶[34]研究发现，采用KAE 干预小鼠BMMSC 后，Runx2和Osterix 的蛋白水平明显上升，同时ALP活性提高。说明KAE 可以提高Runx2水平，促进成骨，抑制OP。Qiu 等[35]通过KAE 作用于BMMSC 细胞，发现KAE 可通过激活Wnt/β-catenin 信号通路，提高Runx2、osterix/Sp-7、β-catenin 等相关蛋白的表达，增加成骨形成。证明KAE 可以通过刺激转录激活剂诱导Runx2来调节BMMSC 的成骨分化和成脂分化来预防OP。综上所述，Runx2是调控Wnt/β-catenin信号通路的重要转录因子，鉴于Runx2在BMMSC 中的作用，Runx2可能通过BMD 发挥作用，在开发治疗骨质疏松的新药研究中具有巨大潜力，有待更深入的研究。

4 小结和展望

随着中国老龄化进程越发加快的社会态势，现代临床治疗OP 的策略虽然起效快，但亦存在副作用大，价格高等弊端。为减轻社会压力，中医药防治OP 已经成为开发新药的必然选择。KAE 作为抗OP 的天然药物比人工合成药物具有明显优势：①不良反应小，可以通过一些膳食来补充。②来源方便，易于获得。③花费少，患者易于接受。由此可见未来中医药防治OP将会成为大趋势。

本文探讨KAE 分别通过调节TNF、IL、Jun 等炎症因子和影响BMP2、Runx2、NF-κB、MAPK、RANKL/RANK、ER 等相关信号通路促进OB 分化、抑制OC 分化来防治OP。目前对于KAE 的研究仅限于体内外研究，临床研究较少。因此，还需要大量临床研究作为依据证明KAE 对OB 和OC 的影响。最后KAE 作为具有巨大潜力防治OP 的有效成分，其治疗OP 的作用靶点尚不明确、具体作用机制及保证效果的用药剂量相关研究还不够全面。因此还需要进行大量的临床试验进行验证，为防治OP 提供更为安全有效的临床方案。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。