液相色谱-质谱技术在骨关节炎局部组织样本检测中的应用进展

刘德仁 廖太阳 吴 鹏 茆 军

南京中医药大学附属医院骨伤科，江苏南京 210029

代谢组学是检测小分子代谢物的先进分析技术，是筛选疾病生物标志物和了解代谢途径的有效工具[1]。液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）作为代谢组学中最常用的分析检测技术，具备高通量定性和定量分析的优势[2-3]。因其所需样本量小、高灵敏度和可靠的定量分析等优点，被广泛应用于描述代谢途径的特征、疾病生物标志物的鉴定及药代动力学的追踪[4-7]。LC-MS 技术通过靶向或非靶向途径确定代谢表型，深刻地阐述疾病的代谢特征[8]。但应用LC-MS 技术揭示骨关节炎（osteoarthritis，OA）发生、发展过程中代谢产物和代谢途径的变化还处于基础阶段，且部分研究着重利用LC-MS 技术检测血清或滑液中代谢物的特征[9-12]。尽管人们运用LC-MS 技术探究OA 生理、病理代谢过程的兴趣愈加热烈，但采用OA 中关节软骨、滑膜和脂肪垫等局部组织作为LC-MS 检测的样本仍处于探索阶段，并且关节软骨、滑膜和脂肪垫等作为OA 病理过程中最直接、最根本的病理改变，更能反映出OA 发生、发展的本质。本文就LC-MS 技术在OA局部组织样本检测中的应用进展进行综述。

1 LC-MS 研究及OA 通用的局部组织样本

1.1 LC-MS 研究

当前，LC-MS、气相色谱-质谱和磁共振波谱是代谢组学中常见的检测技术，前两者占已发表的代谢组学研究的极大部分[13]。LC-MS 技术把具备高分离能力的液相色谱系统作为分离系统，把具备高灵敏度和高选择性的质谱系统作为检测系统，结合二者的优势来检测样本中代谢物和代谢途径的作用[14]。

1.2 常用的局部组织样本

OA 中发生病理改变的局部组织主要涉及关节软骨、滑膜和脂肪垫。微环境变化会引发软骨细胞代谢异常，软骨细胞为了适应该环境，会从一种代谢途径转向另一种代谢途径[15]。OA中关节软骨代谢的整体改变能通过代谢组学检测分析[16]。滑膜炎可能是OA 的初始病理改变，而滑膜在软骨新陈代谢和物质交换中起到关键作用[17]。膝关节局部脂肪组织——髌下脂肪垫可与邻近组织相互作用，能分泌各种细胞因子，可能在OA 中产生双向效应[18]。OA 中针对脂肪垫的分析较少，脂肪垫信号强度的改变与OA 相关生物标志物存在关联[19]。种种证据都指明OA 的发生和发展与关节软骨、滑膜和脂肪垫的代谢改变有着极强的相关性，应用LC-MS 技术分析OA 局部组织样本中代谢物和代谢途径的改变，揭示OA 的潜在病理特征具有丰富前景。

2 LC-MS 技术在OA 局部组织样本检测中的应用

2.1 LC-MS 技术在关节软骨检测中的应用

关节软骨在一定程度反映了关节生理学与病理学，常被选为检测关节疾病的样本。Southan 等[20]对小鼠和猪损伤后关节软骨的LC-MS 非靶向代谢组学进行交叉分析发现，关节软骨损伤后精氨酸和脯氨酸代谢及精氨酸生物合成途径显著富集，调节的还有糖酵解、糖异生和维生素B6代谢途径。Fredrikson等[21]应用LC-MS 技术发现，包裹在微凝胶中的软骨细胞在氨基酸合成和中枢能量代谢相关途径明显上调。这两项研究着重提及关节软骨受影响后主要涉及氨基酸代谢和能量代谢途径的变化。并且值得注意的是，LC-MS 技术是多组学研究中的一环，Southan 等[20]综合代谢组学和转录组学探究关节软骨损伤机制；Anderson 等[22]综合代谢组学和蛋白质组学研究马体外OA 软骨模型，确定一组OA 模型早期差异丰富的代谢物和蛋白质。这映射出将代谢组学与基因组学、蛋白质组学和转录组学等相结合更具说服力，多组学相结合是一种更全面、更科学的拓展OA 研究领域的方法[23-24]。此外，Fredrikson 等[21]将LC-MS 技术作为验证单细胞软骨微凝胶和组织工程的一环，应用LC-MS 技术说明单细胞软骨微凝胶的代谢证据。可见，LC-MS 技术在关节软骨中的应用不能仅限于检测关节软骨中差异代谢物和代谢途径。

2.2 LC-MS 技术在滑膜检测中的应用

Kim 等[25]对OA 和类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）患者的滑膜行LC-MS 检测发现，相比于RA 滑膜，OA 滑膜主要有脯氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等13 种代谢物上调；相比于OA滑膜，RA 滑膜主要有烟酰胺、溶血磷脂酰胆碱（20∶4）、腺嘌呤和单磷酸腺苷等13 种代谢物上调。Li 等[26]检测不同浓度枸杞水提物对OA 模型大鼠滑膜代谢物的影响，鉴定出13 种差异代谢物。近年来，对OA 中滑膜炎和滑膜纤维化的研究众多，但LC-MS 技术中选取滑膜作为样本还需要丰富[27]。研究表明，高速泳动族蛋白B1 和金属蛋白酶等可来源于滑膜，会促进炎症和关节基质降解[28]。可见滑膜作为局部组织样本能有效反映OA 病理发生、发展中代谢改变，选取滑膜作为局部组织样本应用于LC-MS 研究有着很大的研究前景。

2.3 LC-MS 技术在脂肪垫检测中的应用

当前，LC-MS 技术选取脂肪垫作为检测样本的研究较少。Nieminen 等[29]对非炎症性创伤对照、OA 和RA 患者的髌下脂肪垫行LC-MS 非靶向分析，检测到13 种差异代谢物，主要涉及硫酸睾酮、硫酸雄酮、磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱（18∶0）、精氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和胍乙酸，分别与雄激素、胆汁酸和脂质代谢途径相关。可以看出，LC-MS 技术检测脂肪垫差异代谢物可用于OA 与RA 的鉴别，脂质代谢途径在OA与RA 患者中差异显著；雄激素、胆汁酸代谢是OA 与RA 鉴别的前瞻性代谢通路。此外，OA 和RA 患者在髌骨下脂肪垫的脂肪酸特征也存在明显差异[30]。但临床采用脂肪垫作为LC-MS局部组织样本面临侵入性操作问题。因此，OA 局部组织样本的采集是患者在接受手术过程中进行，部分是从患者遗体中采样，例如Carlson 等[31]收集人死后滑液样本。从OA 早期患者中收集局部组织样本面临创伤和患者拒绝等因素，但使用动物模型不能完全复制真实的人类生物环境，从OA 早期患者收集局部组织样本用作LC-MS 研究仍面临困难。

综上，OA 中关节软骨、滑膜和脂肪垫等局部组织代谢紊乱主要是精氨酸、脯氨酸、谷氨酸和溶血磷脂胆碱等代谢物，涉及氨基酸、脂质代谢等代谢途径。精氨酸、脯氨酸和谷氨酸是胶原蛋白的重要组成成分，OA 诱导的纤维化与其含量升高相关[32]。溶血磷脂酰胆碱是一种与疼痛相关的脂质，与OA 患者的慢性疼痛相关[33]；研究还发现，膝关节内注射溶血磷脂酰胆碱会产生持续数天的继发性机械痛觉[34]。

3 小结与展望

综上所述，LC-MS 技术在OA 局部组织样本检测的应用正在丰富，OA 的发生、发展涉及代谢物和代谢途径变化，精氨酸、脯氨酸、谷氨酸和溶血磷脂酰胆碱等代谢物及氨基酸、脂质代谢等多种代谢途径可作为OA 潜在的治疗靶点。但仍需要注意的是，LC-MS 技术所能鉴定出的代谢物数量受限，难以全面阐述机体代谢的全貌，需要克服LC-MS 自身技术局限性，加强样本处理、分析的规范性，尽最大可能保证实验结果的准确性、可信性。必要时，可多组学综合分析。并且，要对LC-MS 技术已识别的OA 局部组织代谢物进行有针对性的研究，不能仅停留在发现差异代谢产物上，需要关联调控这些代谢物的上游蛋白和基因，通过追踪检测、整体分析来了解其在OA 病理、生理中怎样发挥作用；需要进一步的研究来量化和验证这些发现，考虑更大的研究规模，以及更规范、严谨的实验设计。相信LC-MS 技术在OA 局部组织样本的应用研究在不久的将来必定有所突破创新。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。