蒙药复方沙棘颗粒剂中甘草酸单铵盐、总黄酮的含量测定

王海荣 孟柯 特格喜白音 赵岩 乌日娜

【摘 要】

目的：建立蒙药复方沙棘颗粒剂中甘草酸单铵盐、总黄酮的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法，C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）为色谱柱，以乙腈-0.05%磷酸溶液（38∶62）为流动相，体积流量为1.0 mL/min，进样量为10 μL，在252 nm波长下测定甘草酸单铵盐含量；利用紫外可见分光光度法，以芦丁为对照品，在510 nm波长下检测蒙药复方沙棘颗粒剂总黄酮含量。结果：甘草酸单铵盐对照品在0.053～0.530 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，Y=11.003X+0.0031， r=1，平均回收率为105.9%， RSD =1.22%（n=6）；芦丁对照品在2.0～80.0 μg/mL范围内与吸光度值呈良好的线性关系，线性回归方程为Y=11.537X+0.0014，r=0.9999，平均回收率为99.20%， RSD 值为0.54%（n=6）。结论：该方法操作简便，准确，具有良好的精密度、重复性和稳定性，适用于蒙药复方沙棘颗粒剂的质量控制。

【关键词】

蒙药复方沙棘颗粒剂；甘草酸单铵盐；总黄酮；含量测定；质量标准

【中图分类号】R29   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2024）07-0037-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.07.zgmzmjyyzz202407009

Determination of Monoammonium Glycyrrhizinate and Total Flavonoids in Compound Shaji Granules

WANG Hairong1，4 MENG Ke2* Tegexibaiyin3，4 ZHAO Yan4 Wurina2

1.Inner Mongolia Traditional Chinese and Mongolian Medical Research Institute，Hohhot 010010， China;

2.Ordos Institute of Mongolian Medicine， Ordos 017010， China;

3.Affiliated Hospital of Inner Mongolia University for the Nationalities，Tongliao 028007，China;

4.Inner Mongolia International Mongolian Hospital，Hohhot 010065，China

Abstract：

Objective To establish a method for the content determination of monoammonium glycyrrhizinate and total flavonoids in compound Shaji granules.Methods The content of monoammonium glycyrrhizinate was determined by HPLC with C18250 mm×4.6 mm， 5 μm）was used as chromatographic column， acetonitrile-0.05% phosphoric acid （38∶62） as mobile phase， volume flow rate was 1.0 mL/min， injection volume was 10 μL and wavelength was 252 nm.The total flavonoids was determined at 510 nm by UV with rutin as the control.Results Monoammonium glycyrrhizinate had a good linear relationshipin the range of 0.053-0.530 μg.The linear regression equation was Y=11.003X+0.0031， r=1. The average recovery was 105.9%， RSD=1.22% （n=6）.The rutin reference substance showed a good linear relationship with the absorbance value in the range of 2.0-80.0 μg/mL. The linear regression equation was Y=11.537X+0.0014， r=0.9999.The average recovery was 99.20%， RSD=0.54% （n=6）.Conclusion The method is simple， accurate， with good precision， repeatability and stability.It is suitable for the quality control of compound Shaji granules.

Keywords：

Mongolian medicine compound Shaji granules; Monoammonium glycyrrhizinate; Total flavonoids; Content determination; Quality standard

蒙藥复方沙棘颗粒剂组方含沙棘、甘草、白葡萄干、石膏、北沙参、广木香、紫草茸、石榴等15味药材［1］。具有清热、止咳、利痰、平喘功能。用于急慢性支气管炎、肺结核、咽喉炎等见肺热痰多、久咳喘促、胸胀痰稠［2-3］。目前，复方沙棘颗粒剂相关文献报道较少，质量控制相对薄弱，乌兴荣［4］对复方沙棘颗粒剂中异鼠李素的含量进行了测定，但未见以主要药效成分为指标成分的质量控制方法研究报道。沙棘为蒙药复方沙棘颗粒处方中君药，具有止咳祛痰，活血散瘀作用，其主要药效成分为黄酮类，具有抗菌［5］、抗炎［6］的作用。甘草为蒙药复方沙棘颗粒处方中臣药，具有止咳、化痰，清热解毒作用，其主要药效成分为三萜皂苷类、黄酮类化合物［7］。甘草酸为齐墩果烷型五环三萜类化合物，具有抗菌［8］ 、抗炎［9］作用，多以盐的形式存在于药材或复方制剂中。本课题组前期研究已证实，甘草酸在复方沙棘颗粒剂中以甘草酸单铵盐形式存在。本实验采用紫外可见分光光度法测定复方沙棘颗粒剂中总黄酮的含量，采用高效液相色谱法测定制剂中药效成分甘草酸单铵盐的含量，为该制剂质量标准提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Ultimate 3000高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔科技）；KQ-500DE型超声波清洗机（昆山超声仪器有限公司）；BT25S型电子天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司）；UV-1800B型紫外可见分光光度计（上海普美达仪器有限公司）。

1.2 试药 甘草酸单铵盐对照品（成都乐美天医药科技有限公司，批号：DST200301-008），芦丁对照品（成都乐美天医药科技有限公司，批号：DSTDL001601），亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均购于天津市风船化学试剂科技有限公司，均为分析纯，乙腈为色谱纯，水为超纯水。

1.3 分析样品 蒙药复方沙棘颗粒剂（鄂尔多斯市蒙医研究所，批号：22107010，22207015，22207017）。

2 方法与结果

2.1 甘草酸单铵盐测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱选用Thermo scientific C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）;流动相为乙腈：0.05%磷酸溶液，体积比为38∶62；检测波长为252 nm，流速为1.0 mL/min，进样量10 μL。

2.1.2 溶液制备

2.1.2.1 对照品溶液制备 精密称取甘草酸单铵盐对照品，加入70%乙醇制成每1 mL含0.318 mg甘草酸单铵盐的溶液。

2.1.2.2 供试品溶液制备 精密称取蒙药复方沙棘颗粒剂1 g ，精密加入70%乙醇25 mL，超声处理（功率200 W，频率40 kHz） 30 min，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.2.3 阴性溶液制备 按处方比例及制备工艺，配制不含甘草的阴性样品，并按 “2.1.2.2”项下供试品溶液制备方法制成阴性对照液。

2.1.3 方法学验证

2.1.3.1 专属性试验 按“2.1.1”色谱条件测定阴性对照溶液、供试品溶液、甘草酸单铵盐对照品溶液，结果可见，在与对照品色谱中甘草酸单铵盐峰对应的位置上，供试品色谱图检出色谱峰，而阴性对照样品在相应的位置上无相应峰出现，说明方中其他藥味对甘草酸单铵盐的测定无干扰，如图1所示。

2.1.3.2 线性关系考察 取按“2.1.2.1”项下方法制得甘草酸单铵盐的对照品溶液（0.053 mg/mL），分别进样1.0 μL、2.0 μL、4.0 μL、6.0 μL、8.0 μL、10.0 μL，在“2.1.1”项下色谱条件下进行检测，记录色谱峰的峰面积。再以横坐标为甘草酸单铵盐进样量（μg），纵坐标为不同进样体积所对应的色谱峰峰面积绘制标准曲线，结果得甘草酸单铵盐进样量在0.053～0.530 μg范围内，线性关系良好，回归方程为Y=11.003X+0.0031， r=1。

2.1.3.3 精密度试验 取按“2.1.2.2供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液，在上述色谱条件，连续进样6次，记录每次所测的色谱峰面积。甘草酸单铵盐峰面积的RSD（n=6）为0.57%，表明仪器精密度良好。

2.1.3.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样，分别于0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h测定，以甘草酸单铵盐峰面积计算，其峰面积的RSD为1.8%，室温条件24 h内，样品稳定性良好。

2.1.3.5 重复性试验 取批号为22107010蒙药复方沙棘颗粒剂，按“2.1.2.2”项下供试品溶液制备法，平行处理6份，按“2.1.1”项下色谱条件测定颗粒剂中甘草酸单铵盐的含量，计算得甘草酸单铵盐的含量均值为0.7046 mg/g，RSD为0.41%（n=6），结果表明，该方法具有良好的重复性。

2.1.3.6 回收率试验 分别精密称取已知甘草酸单铵盐含量（0.7478 mg/g）的样品0.5 g，各6份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入浓度为0.4 mg/g的甘草酸单铵盐对照品1.0 mL（约相当于供试品含有量的50%），按照供试品溶液的制备方法和色谱条件进样检测，计算加样回收率和RSD值。平均回收率为105.9%，RSD为1.22%。表明该方法具有良好的准确度。结果见表1。

2.1.3.7 样品测定 取不同批次样品，按上述供试品溶液的制备方法和测定条件，测定了3批蒙药复方沙棘颗粒剂中甘草酸单铵盐含量，每批平行测定3份，结果见表2。

2.2 总黄酮含量测定

2.2.1 溶液制备

2.2.1.1 对照品溶液制备 精密称取芦丁对照品5 mg置25 mL容量瓶中，加60%乙醇定容至刻度，摇匀。

2.2.1.2 供试品溶液制备 精密称取复方沙棘颗粒剂3 g，加60%乙醇50 mL超声提取，滤液过滤，取1 mL样品置10 mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠0.3 mL，摇匀，6 min后再加10%硝酸铝0.3 mL，摇匀，6 min后再加氢氧化钠试液4 mL，摇匀，加60%乙醇定容至刻度，摇匀，静置15 min，即得供试品溶液。

2.2.2 检测波长确定 取“2.2.1.1”项下芦丁对照品溶液、“2.2.1.2”项下供试品溶液，用紫外-可见分光光度计在200～600 nm进行全波长测定。结果显示供试品和对照品溶液均在510 nm处具有较大吸收，故确定检测波长为510 nm。

2.2.3 线性关系考察 精密量取芦丁对照品溶液（0.2 mg/mL）0.1 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL分别置于10 mL容量瓶中，各加30%乙醇至5 mL，加5%亚硝酸钠0.3 mL，摇匀，6 min后再加10%硝酸铝0.3 mL，摇匀，6 min后再加氢氧化钠试液4 mL，摇匀加30%乙醇定容至刻度，摇匀，静置15 min。以溶剂为空白，用紫外可见分光光度计在510 nm处检测其吸光度值，以吸光度Y为纵坐标，测定浓度X（mg/mL）为横坐标进行线性回归，得芦丁的回归方程为Y= 11.537X+0.0014，r=0.9999，表明芦丁含量在2.0～80.0 μg/mL范围内其质量浓度与吸光度呈良好线性关系。

2.2.4 精密度试验 取蒙药复方沙棘颗粒剂（批次为22107010）1份，按照“2.2.1.2”方法制备供试品溶液，重复测定6次。峰面积的RSD（n=6）为0.05%，表明仪器精密度良好。

2.2.5 重复性试验 精密取蒙药复方沙棘颗粒剂（批次为22107010）6份，按照“2.2.1.2”方法制备供试品溶液，测定吸光度，计算颗粒剂中总黄酮含量，得含量平均值为12.141 mg/g， RSD为0.94%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.2.6 稳定性试验 精密吸取“2.2.1.2”方法制备的供试品溶液1.0 mL置于10 mL容量瓶中，按“2.2.1.2”项下静置20 min、25 min、30 min、35 min、40 min、45 min、50 min、55 min、60 min后，在510 nm波长处测定吸光度值， RSD为1.48%，表明供试品溶液在60 min内稳定性良好。

2.2.7 加樣回收率试验 取已知总黄酮含量的复方沙棘颗粒剂（批号为22107010）研细药粉约1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入一定量的芦丁对照品（加入量与样品中芦丁含量比例约1∶1），照“2.2.1.2”项下供试品溶液制备方法自“60%乙醇50 mL超声提取”起，制备回收率供试品溶液，平行制备6份，在波长510 nm下测定吸光度值，记录吸光度值，计算回收率，结果平均回收率为99.20%， RSD值为0.54%（n=6），说明该方法准确度良好。

2.2.8 样品测定 取不同批次样品，按照“2.2.1.2”方法制备供试品溶液，测定3批蒙药复方沙棘颗粒剂中总黄酮含量，每批平行测定3份，结果见表3。

3 讨论

蒙药复方沙棘颗粒剂处方中君药沙棘和臣药甘草，均富含黄酮类化合物，黄酮类化合物具有抗炎、抗菌作用，故选择总黄酮为指标成分，测定其含量可有效反映复方沙棘颗粒剂的质量。本文建立的紫外可见分光光度法，以芦丁为对照品，在510 nm波长下检测蒙药复方沙棘颗粒剂总黄酮含量，方法操作简便、准确可靠。HPLC法测定甘草酸单铵盐含量时，首先参考2020年版《中华人民共和国药典》一部药典“甘草”项下甘草酸单铵盐含量测定方法［10］，流动相为乙腈-0.05%磷酸溶液，梯度洗脱时甘草酸单铵盐色谱峰未能与其他干扰峰得到很好的分离。经过色谱条件探索，在不改变流动相组成的前提下将梯度洗脱改为等度洗脱，流动相比例调整成38∶62时，待测成分能够达到基线分离且峰形良好，阴性无干扰，可用于测定蒙药复方沙棘颗粒剂中甘草酸单铵盐的含量。

综上所述，本研究所建立的 HPLC 法和紫外可见分光光度法快速简便、准确度高、重复性好，为蒙药复方沙棘颗粒剂质量控制提供了科学依据。

参考文献

［1］乌日娜，那生桑，包勒朝鲁.复方沙棘颗粒剂的喷雾干燥工艺优选［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（4）：56-58.

［2］乌日娜.蒙药复方沙棘颗粒剂制备工艺研究［D］.呼和浩特：内蒙古医科大学，2013.

［3］萨日盖，红梅，那生桑.蒙药复方沙棘颗粒剂对熏烟致小鼠慢性气管-支气管炎的影响［J］.中国民族医药杂志，2014，20（1）：39-40.

［4］乌兴荣.高效液相色谱法测定复方沙棘颗粒中异鼠李素的含量［J］.中国民族医药杂志，2014，20（3）：56-57.

［5］王健，张珍珍，梅秀珍，等.黄酮类化合物的抗菌作用及机制研究进展［J］.江苏农业科学，2023，51（1）：1-8.

［6］唐春丽，魏江存，滕红丽，等.黄酮类成分抗炎活性及其作用机制研究进展［J］.中华中医药学刊，2021，39（4）：154-159.

［7］肖先，李春燕，刘晓龙，等.甘草的主要化学成分及药理作用研究进展［J］.新乡医学院学报，2023，40（3）：280-285.

［8］栾祖香，徐子恒，董秀凯，等.HPLC检测甘草颗粒中甘草酸及其抗菌活性［J］.中国兽医学报，2018，38（5）：974-977.

［9］张明发，沈雅琴.甘草酸及其衍生物的抗炎和抗变态反应研究进展［J］.现代药物与临床，2011，26（5）：359-364.

［10］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2020：89.

（收稿日期：2023-07-25 编辑：刘 斌）

基金项目：

2017年内蒙古自治区科技计划项目“蒙药复方沙棘颗粒剂新药研究”。

作者简介：

王海荣（1987—），女，蒙古族，硕士，副主任药师，研究方向为中（蒙）药分析与质量控制。E-mail： 562322818@qq.com

通信作者：

孟柯 （1962—），男，蒙古族，本科，主任医师，研究方向为民族医学。E-mail： munh_9017@163.com