髋关节置换缺血性脑卒中粒细胞胞外陷阱的作用

张吉美，于芳洲，耿榆杰，李作伟，2*

（1.山东中医药大学第一临床医学院，山东济南 250014；2.山东中医药大学附属医院神经内科，山东济南 250014）

中性粒细胞细胞外陷阱（neutrophil extracellular traps,NETs）是由脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid,DNA）、组蛋白和中性粒细胞颗粒蛋白在胞外构成的网状复合物，由Brinkmann 等［1］于2004 年首次报道。NETs 一方面具有强大的抗菌作用，另一方面产生过多或清除不彻底，导致炎性疾病和自身免疫性疾病的发生和发展［2］，其病理后果包括血栓形成和纤溶障碍［3］。NETs 参与动脉血栓形成，脑梗死患者的血栓中NETs 含量明显升高［4］，髋关节置换缺血性脑卒中是少见且严重的并发症之一，髋关节置换患者术后出现具有高效促炎作用的NETs［5］，NETs 在髋关节置换缺血性脑卒中发挥着重要作用。本文就NETs 生物学特性进行研究，通过对以往国内外相关研究的回顾，将对NETs 在髋关节置换缺血性脑卒中诊疗中的作用进行分析和讨论，为今后此病的预防、治疗提供新的思路。

1 NETs 的概述

NETs 的产生过程称为NETosis［6］，是先天免疫系统的一种细胞现象，DNA 是NETs 的骨架结构；组蛋白是NETs 的重要组成部分，通过细胞Toll 样受体4（toll-like receptors 4, TLR4）信号介导的方式造成细胞及组织损伤；中性粒细胞颗粒蛋白，如髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）、中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE）、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）、肽基精氨酸脱氨酶4（peptidyl arginine deiminase 4, PAD4）、蛋白酶3（proteinase3,PR3）等，与DNA、组蛋白组成带有强大负电荷的网状结构。细菌、病毒、真菌、活化的血小板等均能诱导NETs 的产生，NETs 形成的主要机制分为中性粒细胞裂解模式和非裂解模式。

1.1 NETs 形成的中性粒细胞裂解模式

在裂解模式NETs 形成过程中，中性粒细胞诱导烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶活化，通过释放活性氧（reactive oxygen species,ROS）分解中性粒细胞内的颗粒膜和核膜，随后MPO、NE 自由入核结合并降解组蛋白［7］；ROS 激活PAD4 将组蛋白精氨酸转化为瓜氨酸，破坏DNA 和组蛋白间的静电荷关联，使染色质解聚，染色质和颗粒蛋白被释放到细胞外，形成NETs。某些诱导因素如尼古丁可导致线粒体ROS 释放并激活PAD4，催化组蛋白H3（citrullinated histones 3, H3Cit）使其瓜氨酸化，解聚染色质，从而形成NETs［8］。

1.2 NETs 形成的中性粒细胞非裂解模式

在非裂解模式NETs 形成过程中，病原体或体内病理性产物刺激中性粒细胞，血小板与中性粒细胞、补体受体结合，或TLR 与感染性刺激因素结合，可活化PAD4，随后解聚的染色质和颗粒蛋白通过核膜的出芽形式释放到细胞外，形成中性粒细胞非裂解模式NETs［9］。

2 NETs 在髋关节置换缺血性脑卒中的作用机制

髋关节置换术是多种终末期髋关节疾病的有效治疗手段［10］，多用于治疗股骨头坏死、股骨颈骨折、强直性脊柱炎、先天性髋关节脱位、髋臼发育不良等疾病［11］，可缓解疼痛、改善关节功能、提高生活质量。髋关节置换缺血性脑卒中发生率为0.2%～0.5%［12］，其致残率高，甚至危及生命。手术创伤引起创伤炎症反应激活NETs，诱发高凝状态、血小板聚集、凝血功能亢进、动脉粥样硬化斑块脱落，导致血栓形成。髋关节置换缺血性脑卒中的发生机制复杂且影响因素较多，NETs 发挥着重要作用，其在髋关节置换缺血性脑卒中的机制如下：

2.1 NETs 大量释放使血液处于高凝状态

手术创伤性炎症刺激下中性粒细胞活化释放大量的NETs，通过上调细胞磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）和P-选择素（P-selectin）表达，诱导血液处于高凝状态［13］，NETs 提供纤维样骨架结构，形成血栓栓子，栓子伴随着血液循环栓塞颅内动脉。研究表明，在膝关节置换术后血液呈高凝状态，而且NETs 在其术后下肢深静脉血栓患者中呈高表达［14］，髋关节置换术作为创伤性炎性刺激引起中性粒细胞活化，大量NETs 形成及释放促进血液高凝。

2.2 NETs 促进血小板高效聚集和血栓形成

术后活化的血小板分泌高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein,HMGB1），通过晚期糖基化终产物受体（receptor of advanced glycation end products, RAGE）、TLR2 和TLR4 受体激活中性粒细胞，诱导NETosis，组蛋白与血小板结合诱导Ca2+内流，血浆黏附蛋白（如纤维蛋白原）促进血小板微聚集，同时组蛋白诱导血小板高效聚集，形成大的血小板聚集物［15］，NETs 的大型网状结构有利于血小板聚集和血栓形成。

损伤的内皮细胞释放白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、白介素-8（interleukin-8,IL-8）和ROS等细胞因子调节中性粒细胞活性，加速NETs 形成［16］。NETs 释放的金属蛋白酶、NE、组织蛋白酶G和蛋白酶3 可以破坏内皮细胞之间的连接［17］。与此同时，NETs 再次激活内皮细胞，促进血小板产生血栓素A2（thromboxane A2, TXA2）和P-Selectin，激活血管细胞粘附分子1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1）和细胞内粘附分子1（intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1），促进中性粒细胞迁移。NETs 产生过程中释放出大量自身抗原，从而加剧血栓形成［18］。

2.3 NETs 促进凝血酶产生、激活部分凝血因子，促进凝血功能

NETs 具有激活外源性和内源性凝血级联的能力［19］，在触发凝血途径中，来自NETs 的纯化DNA骨架诱导血浆产生凝血酶［20］，NETs 中组蛋白通过TLR2 和TLR4 激活血小板来诱导富血小板血浆中凝血酶的生成。凝血级联反应的限速步骤中凝血酶将纤维蛋白原裂解成纤维蛋白，NETs 通过内在的凝血途径促进外周血纤维蛋白和凝血酶的形成。NETs 的成分，例如H3Cit 和组蛋白H4（citrullinated histones 4,H4Cit），对内皮细胞具有高度细胞毒性，组蛋白通过与凝血调节蛋白结合并防止活化蛋白C 的激活，促进凝血酶的产生［21］。一项创伤动物模型研究显示，在损伤3 h 后，NETs 产生并加速凝血酶生成，诱导创伤性凝血［22］。研究证实，凝血因子XII（Factor XII,FXII）和凝血因子XI（factor XI,FXI）会导致血栓形成，NETs 与FXII 结合并刺激纤维蛋白形成［23］。

2.4 NETs 促进动脉粥样硬化斑块形成，并破坏其稳定性，导致斑块脱落

NETs 激活动脉粥样硬化病灶内浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells, PDCs）的自身免疫，引起大量干扰素合成和释放，进而强化炎症反应，促进动脉粥样硬化进展［24］。Warnatsch 等［25］证明，胆固醇晶体作为动脉粥样硬化的高危因素，触发中性粒细胞释放NETs，诱导巨噬细胞释放细胞因子并激活辅助性T 细胞17（T helper cell 17, Th-17），增强动脉粥样硬化斑块中免疫细胞聚集，促进动脉粥样硬化斑块形成。

与稳定斑块相比，不稳定斑块样本中巨噬细胞、单核细胞、B 细胞和未成熟树突状细胞的水平明显增高。目前确定补体片段C5a 受体1（complement component 5a receptor 1,C5aR1）、水通道蛋白9（aquaporin 9, AQP9）和唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9（Sialic acid-binding Ig-like lectin 9,SIGLEC9）3 个特征性基因与基于NETs 形成的动脉粥样硬化斑块关系密切。C5aR1 与补体系统中最强大的炎症蛋白之一C5a 相互作用［26］，通过触发核苷酸结合域和富亮氨酸重复蛋白3 炎性体来加速动脉粥样硬化的发展，NE 具有C5 转化酶活性，可裂解C5 蛋白，从而生成C5a，进而诱导NETs 形成并降低动脉粥样硬化斑块稳定性。Inouye 等［27］发现动脉粥样硬化病变小鼠肝组织中AQP9 高表达。然而，SIGLEC9 能够诱导中性粒细胞的凋亡，抑制单核巨噬细胞浸润［28］，阻止动脉粥样硬化的发生和进展。

随着老龄化加剧，髋关节置换术患者多为老年人群，合并多种内科疾病，尤其是糖尿病［29］，动脉粥样硬化加重了高龄患者髋关节置换缺血性脑卒中风险，NETs 的释放诱导平滑肌细胞死亡，导致斑块稳定性降低，增加斑块破裂栓子脱落风险。

3 NETs 在髋关节置换缺血性脑卒中诊疗中的作用

NETs 在缺血性脑卒中病理过程中发挥着重要作用。研究发现，缺血性卒中患者急性期血浆中NETs的循环水平显著增加［30］，脑梗死后3～5 d 达高峰［31］。缺血性脑卒中以意识障碍、肢体活动障碍、言语不利等神经功能缺损等为主要临床表现，致残率高，严重者危及生命。骨科创伤后早期，具有强效促炎作用的NETs 会大量释放［5］，特别是在髋关节置换术后3～5 d NETs 释放量达高峰，预防关节置换术后脑梗死对关节置换患者非常重要［32］，早期检测NETs生物标志物可预测术后缺血性脑卒中发生，抑制NETs 形成或促进NETs 降解是预防、治疗髋关节置换缺血性脑卒中新的思路。

3.1 NETs 在预测髋关节置换缺血性脑卒中的作用

对急性脑梗死患者行取栓治疗后，发现其血栓中NETs 含量高的患者预后较差［33］，检测外周血中NETs 的数量可预测脑梗死的发生及严重程度［34］，缺血性脑卒中作为髋关节置换术后严重并发症，特别是70 岁以上高龄患者，髋关节置换脑梗死发生率明显升高，利用外周血对髋关节置换术后患者进行NETs相关生物标志物检测可以预测发生缺血性脑卒中的风险，其相关生物标志物主要有血浆游离H3Cit、血浆游离DNA（cell-free DNA,cfDNA）和MPO。

Kang 等［31］的研究表明，H3Cit 是目前可用于检测NETs 形成更具体的标记物之一，其敏感性和特异性均为88%［35］。缺血性脑卒中患者血浆中NETs 标记物H3Cit 水平与死亡率呈正相关，H3Cit 也是评估急性缺血性脑卒中预后的有效标志物。DNA 是NETs的重要组成部分，cfDNA 代表释放的NETs，是NETs的替代标记物，其特异性和敏感性达95%以上［35］，性能优异。MPO 作为NETs 的分解产物释放到细胞外，在脑缺血再灌注损伤的病理过程中触发氧化应激反应，为脑卒中的早期诊断和病情评估提供参考价值，其敏感性达94%［35］。

3.2 NETs 在髋关节置换缺血性脑卒中预防、治疗中的应用

NETs 促进血栓形成，NETs 是预防、治疗缺血性脑卒中的靶点［17］，髋关节置换术后创伤性炎症刺激诱导NETs 产生并大量释放，导致血液高凝状态、血小板高效聚集、促进凝血酶产生、激活部分凝血因子、动脉粥样硬化斑块稳定性下降等，因此抑制NETs 形成，或促进NETs 降解，可有效预防、治疗髋关节置换缺血性脑卒中。

3.2.1 抑制NETs 的形成

血栓形成依赖于中性粒细胞中的PAD4，PAD4不可逆抑制剂（如氯脒） 与PAD4 活性位点的Cys645 共价结合，显着减少组蛋白瓜氨酸化并抑制NETs 形成。GSK199 和GSK484 被开发为PAD4 的有效选择性抑制剂，可抑制NETs 的形成［36］，PAD4 抑制剂的高亲和力和高特异性，成为未来研究突破的重点。

ROS 促进内皮功能障碍、增加血管通透性，线粒体ROS 由NADPH 氧化酶非依赖性途径产生，利用抑制性药物抑制NADPH 氧化酶的活性，进而减少NETs 生成，减轻组织的氧化损伤，氧自由基清除剂依达拉奉可清除体内自由基而减少NETs 产生，明显改善神经功能［37］。

NE 能损伤血管内皮细胞，增加组织通透性，促进炎性因子释放,NE 抑制剂西维来司钠能可逆性和竞争性抑制NE 释放，在急性脑缺血损伤后发挥神经保护作用［38］。

他汀类药物通过抑制中性粒细胞介导的炎症反应抑制NETs 形成，同时改善重组组织型纤溶酶原激活剂（recombinant tissue plasminogen activator, at-PA）诱导的出血转化［39］。阿托伐他汀可减少TLR4 表达及其下游通路的激活，起到抗炎作用［40］，同时阿托伐他汀具有调脂作用，并通过抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移［41］，稳定斑块。

3.2.2 促进NETs 的降解

脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease, DNase）是一种已知NETs 降解酶［42］，脱氧核糖核酸酶I（deoxyribonuclease I, DNaseI）和at-PA 联合使用可加速急性缺血脑卒中早期的体内溶栓。CdcPDE 是一种磷酸二酯酶，能够抑制二磷酸腺苷（adenosine diphosphate, ADP）诱导的血小板聚集，降解NETs 中的cfDNA，CdcPDE 的出现使DNase I 疗法有望成为治疗和预防血栓形成的新治疗概念［43］。NETs 可能通过激活血小板和内皮细胞促进急性脑梗死at-PA 抵抗，at-PA 可诱导中性粒细胞脱颗粒形成NETs，导致出血转化和溶栓抵抗，当at-PA 联合DNase I 进行溶栓治疗时效率更高［44］，是提高患者at-PA 溶栓效率的一种治疗方法。

4 展 望

NETs 异质性强，其生物标志物H3Cit、cfDNA和MPO 具有较高的特异性和敏感性，靶向预防NETs形成可成为防止髋关节置换缺血性脑卒中发生的新方法。目前针对NETs 研究结果大部分来自动物模型研究，具有局限性，随着分子生物学发展，相信基于NETs 表达，更多NETs 生物标志物可用于协助预测髋关节置换缺血性脑卒中发生，预防和治疗的靶向药物将逐渐问世，早期预防，早期诊断，早期治疗，从而降低髋关节置换缺血性脑卒中的发生，改善预后。