警报素在椎间盘退变中作用的研究进展△

罗章斌，邱晓明，张亦智，康学文

（兰州大学第二医院骨科，甘肃兰州 730030）

椎间盘由位于中央的髓核、四周包绕的纤维环以及顶部和底部的软骨终板构成［1］。髓核的营养供应主要来自软骨终板中的血管网，作为一个相对缺乏血供的组织，髓核内部是一个相对缺氧、代谢产物堆积的酸性环境［2，3］。在人体内部，存在着病原相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern, PAMP）和损伤相关分子模式（damage-associated molecular pattern,DAMP）这两种免疫应答方式，PAMP 主要与微生物的入侵相关，DAMP 主要识别机体的组织损伤［4］。这两种模式可以触发细胞信号通路，导致产生多种蛋白质，这些蛋白质会参与对外界环境的应答。尽管一部分研究指出，椎间盘退变（intervertebral disc degeneration,IVDD）的发生可能与感染存在着部分关系［5，6］，但同时有研究指出，DAMP 也可能是IVDD 的重要原因之一［7～9］。高迁移率族蛋白B1（high mobility group box-1 protein, HMGB1）、热休克蛋白（heat shock protein, HSP）、S100 蛋白家族、白细胞介素-1α（interleukin-1α, IL-1α）和白细胞介素-33 （interleukin-33, IL-33）等蛋白作为警报素，参与DAMP 所引起的IVDD 过程。

1 高迁移率族蛋白B1

HMGB1 是高度保守的非组蛋白家族的一员，因其特有的快速电泳迁移速度而得名。尽管HMGB1 具有高丰度和保守性，但其主要作为细胞外信号因子进行研究。HMGB1 可由活化的单核细胞和巨噬细胞等细胞主动分泌，或由坏死和受损细胞被动释放，发挥报警蛋白的作用［10］。研究指出，HMGB1 在退变髓核组织中明显高表达。当过表达该蛋白时，髓核细胞活力降低，增殖变慢。此外，HMGB1 过表达可以促进髓核细胞凋亡、细胞外基质降解以及细胞自噬［11］。有研究证实，HMGB1 的表达随着患者髓核样本中变性严重程度的增加而增加。HMGB1 的基础表达定位于细胞核和细胞质，当脂多糖（lipopolysaccharide,LPS） 作用于髓核细胞后，细胞为了响应应激，HMGB1 从细胞核转移到细胞质，然后在细胞外释放。当用HMGB1 重组蛋白作用于髓核细胞后，可以剂量依赖性方式促进白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）和基质金属蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1,MMP-1）的基因和蛋白质产生，其可能的原因是HMGB1 通过激活Toll 样受体4（toll-like receptor 4, TLR4）来激活核因子κB（nuclear factor-κB, NFκB）信号通路，从而导致髓核细胞炎症和髓核组织降解的发生［9］。除此之外，血清剥夺也可能是HMGB1 表达上调的原因之一。为了应对血清剥夺应激，HMGB1 从细胞核转移到细胞质，最终在细胞外释放。研究进一步证实，血清剥夺会导致纤维环细胞发生自噬，细胞核和细胞质中HMGB1 的独立测量显示细胞质HMGB1 强度与微管相关蛋白1 轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3）斑点形成密切相关，这表明细胞质中的HMGB1 可以作为椎间盘纤维环细胞中的自噬传感器，并可作为一种有用的自噬标志物［12］。另外，HMGB1 在髓核作用于背根神经节（dorsal root ganglion, DRG）之后引起的疼痛相关行为的发展中起重要作用。大鼠髓核免疫组化显示，髓核中含有HMGB1。将髓核组织置于DRG附近，可导致疼痛相关行为的发生。但是，术后腹腔注射抗HMGB1 中和抗体的大鼠，疼痛相关行为会得到改善，其DRG 中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor, TNF-α）的表达也会显著降低。HMGB1 的阻断治疗有望成为神经性疼痛的一种新的治疗方法［13］。

白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）是引起髓核细胞退变的原因之一。当IL-1β 作用于髓核细胞后，会导致髓核细胞发生细胞外基质降解、炎症反应和凋亡的发生。甘草甜素（glycyrrhizin, GL）是HMGB1 的有效抑制剂，当其作用于髓核细胞后，会逆转IL-1β 的作用。GL 可以通过抑制p38/c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun amino terminal kinase,JNK）信号通路来抑制HMGB1 的表达，抑制炎症和细胞凋亡，同时抑制髓核细胞外基质降解。GL 有可能成为治疗IVDD 的新型细胞因子［14］。另有研究指出，IL-1β 处理同样会引起HMGB1 的表达增加，而p38 抑制剂TAK-715 处理髓核细胞后则会逆转IL-1β 的作用，HMGB1 的表达同样会减少［15］。以上结果提示，靶向p38 和HMGB1 的药物可能是一种针对IVDD 新颖的治疗方法。

IVDD 的原因之一是髓核细胞基质代谢失衡，与TNF-α 等炎症因子有关。将髓核细胞用TNF-α 处理后，可导致髓核细胞发生衰老、焦亡，并促进细胞外基质分解代谢，同时还会导致HMGB1 的表达升高［16，17］。但是，在用GL 抑制HMGB1 或用小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）敲减HMGB1 的表达后，由TNF-α 诱导的髓核细胞的退变过程会得到缓解。瑞舒伐他汀是一种在临床上广泛用于降低胆固醇水平、具有抗炎作用的药物。瑞舒伐他汀可以通过下调HMGB1 表达的同时，抑制NF-κB 信号通路来减轻TNF-α 诱导的髓核细胞焦亡和衰老的发生，同时缓解细胞外基质的降解［16］。有研究指出，高压氧处理可能是治疗IVDD 的手段之一。将髓核细胞置于高压氧环境后，microRNA-107（miR-107）的表达显著增加，由于HMGB1 是miR-107 的直接目标，下游的HMGB1 的表达会被抑制。高压氧可以通过抑制HMGB1 的表达来进一步发挥抗炎的作用［18］。用LPS处理THP-1 细胞，可以诱导巨噬细胞M1 极化，同时促进HMGB1 的表达升高。但是木兰花碱（magnoflorine,MAG）则可以有效抑制THP-1 细胞的M1 极化，同时抑制炎性因子和HMGB1 的表达。同样地，IL-1β 可以促进髓核细胞HMGB1 的产生，而MAG则会抑制HMGB1 的升高。此外，当用M1 极化的THP1 细胞条件培养基作用于髓核细胞后，HMGB1的表达也会增加，而加入了MAG 的条件培养基则会抑制HMGB1 的产生。MAG 通过下调HMGB1 来缓解M1 极化巨噬细胞介导的IVDD 的体外模型［19］。总之，GL、瑞舒伐他汀、MAG 以及高压氧均可以通过HMGB1 这一靶点缓解椎间盘的退变。

2 热休克蛋白

HSP 也被称为分子伴侣蛋白，是一类广泛存在于细胞内的蛋白质家族。它因对热休克存在反应而得名，其主要功能是应对潜在的危险情况［20］，HSP 家族也在椎间盘的退变过程中扮演着重要的角色。机械负荷会影响椎间盘中细胞的行为和细胞外基质的代谢平衡［21］。有研究指出，在机械负荷加载2 h 后，牛髓核中热休克蛋白70（HSP70）显著上调，而在去除机械负荷后恢复［22］。此外，有研究指出，线粒体裂变和融合的失调与多种疾病的发病机制有关，压缩负荷会诱导髓核细胞发生线粒体裂变，还会引起髓核细胞外基质分解代谢和线粒体凋亡途径。但是，在促进HSP70 的表达后，被压缩负荷诱导的线粒体裂变、细胞外基质分解代谢以及线粒体途径凋亡均会得到缓解，这一过程部分是通过HSP70 上调蛋白质赖氨酸脱酰基酶3（sirtuin3, SIRT3）的表达来实现的［23］。HSP70 对髓核细胞有着一定的保护作用。用叔丁基过氧化氢（tert-butyl hydroperoxide,TBHP）处理髓核细胞，可引起细胞活力丧失，线粒体凋亡和衰老的发生，还可以增加活性氧（reactive oxygen species,ROS），造成线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）的崩溃，以及促进三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）的消耗。但是，用HSP70诱导剂TRC051384 可以下调JNK/c-Jun 通路，减轻TBHP 诱导的髓核细胞的凋亡和衰老，以及氧化应激的发生［24］。在缺氧条件下，HSP70 的表达也会发生变化。用HSP70 转录抑制剂KNK437 处理髓核细胞后，缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）蛋白的稳定性和转录活性均有所增加。同样，当HSP70 过表达时，HIF-1α 的稳定性和转录活性下降。HSP70 在缺氧条件下与HIF-1α 相互作用，HSP70 可能通过蛋白酶体途径促进髓核细胞HIF-1α的降解［25］。总之，HSP70 在髓核应对各种环境时发挥着重要的作用。

近期研究指出，巨噬细胞的极化对髓核细胞有一定的影响。巨噬细胞M1 极化的条件培养基可以导致髓核细胞发生炎症和细胞外基质分解代谢，但是HSP90 抑制剂（17-AAG）通过抑制丝裂原活化蛋白激酶和NF-κB 途径来阻碍巨噬细胞的M1 极化来减弱条件培养基的促炎活性，还可以通过上调HSP70和抑制Janus 激酶2-信号传导和转录激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3,STAT3）通路，最终减轻了M1 极化巨噬细胞诱导的髓核细胞炎症和分解代谢［26］。研究指出，血管长入会造成髓核内部的物质代谢、微环境等的改变［27］。IVDD 常伴有髓核纤维化和病理性血管生成，可能与巨噬细胞浸润有关。免疫染色显示严重退行性人椎间盘组织中血管长入与巨噬细胞浸润之间存在空间关联，并且在严重退行性人椎间盘组织中细胞迁移诱导蛋白（cell migration inducing protein, CEMIP）和血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGFA）水平升高，CEMIP 参与多种组织的纤维化表型，VEGFA 和成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2,FGF2）与血管的长入相关。M1 和M2极化的巨噬细胞条件培养基可以提高髓核细胞中CEMIP 的表达，导致髓核细胞纤维化的发生，还可以提高髓核细胞中VEGFA 和FGF2 的表达，但是17-AAG 可以通过抑制CEMIP 来改善巨噬细胞诱导的髓核细胞纤维化表型以及病理性血管生成过程［28］。类似的研究指出，抑制HSP90 在一定程度上可以保护髓核细胞。研究指出，压缩可以触发受体相互作用蛋白激酶 1 （receptor interacting protein kinase 1,RIPK1）/受体相互作用蛋白激酶3（receptor interacting protein kinase 3, RIPK3）/混合谱系激酶结构域样蛋白 （mixed lineage kinase domain like protein,MLKL）导致的髓核细胞坏死性凋亡，引起线粒体功能障碍和氧化应激的发生。但是，抑制HSP90 可以调节RIPK1/ RIPK3/ MLKL 的表达和活性进而显著减轻坏死性凋亡，并减轻线粒体功能障碍和氧化应激的发生［29］。在一项对人退行性髓核组织的免疫组化结果中指出，HSPA8 在腰椎间盘髓核组织中稳定表达，但是其表达随着IVDD 的严重程度而逐渐降低［30］。总之，HSP 家族在IVDD 中发挥着重要的作用，更详细的作用机制仍需要进一步探索。

3 S100 蛋白家族

S100 蛋白家族由结构高度相似、但具有不同功能的成员组成，该蛋白家族在细胞内充当钙离子传感器并通过调节细胞外因子来调控细胞反应，参与炎症反应、细胞增殖、肿瘤转移、血管生成和免疫逃逸等过程［31］。研究指出，警报素成员中的S100A8、S100A9 蛋白参与椎间盘的退变过程。研究指出，S100A8 和S100A9 在严重退化的人髓核组织中显著升高。当S100A8 和S100A9 重组蛋白作用于髓核细胞后，可以促进基质分解酶MMP-3、MMP-13，以及具有血小板反应蛋白基序以及去整合素和金属蛋白酶活性的蛋白-4（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4, ADAMTS-4）的表达显著上调，抑制细胞外基质聚集蛋白聚糖（aggrecan）和Ⅱ型胶原（collagen Ⅱ） 的表达；S100A8 和S100A9 还会引起炎症因子IL-1、IL-6、IL-8 和TNF-α 的基因表达增加［32，8］。此外，S100A9 还会导致髓核细胞发生凋亡，促凋亡蛋白BCL2 相关X 蛋白、细胞色素C 及切割的胱天蛋白酶3 的表达量显著升高［32］。具体的作用通路可能是S100A8 和S100A9 会与TLR4 结合，进一步诱导p65 核转位，从而激活NF-κB 信号通路，导致促凋亡、促降解和促炎作用的发生，该过程可以被NF-κB 特异性抑制剂所逆转［32，8］。此外，S100A12 作为S100 家族的重要成员之一，在牙周炎、骨关节炎、类风湿关节炎等疾病的发展中有着重要的意义［33～35］。尽管S100A12在IVDD 过程中的作用尚未报道，但是相信在不久的将来，S100A12 将会是治疗IVDD 的重要靶点之一。

4 IL-1α 和IL-33

IL-1α 和IL-1β 均是来自IL-1 家族的成员，IL-1β 在椎间盘的退变过程中发挥着重要的作用［36］。与IL-1β 不同，IL-1α 是一种双重功能的细胞因子，通过原位IL-1α 的核易位或裂解的N-末端前肽来发挥生物学功能［37］。在先前的一项流行病学研究中，观察到具有2 个IL-1α（+889C/T）等位基因（TT 基因型）的个体与没有该等位基因（CC 基因型）的个体相比，IVDD 的风险增加了3 倍以上［38］。另有荟萃分析指出，IL-1α（+889C/T）的基因多态性可增加纯合、隐性和等位基因模型下IVDD 的风险，尤其是在高加索人中。相比之下，IL-1β（+3954C/T）多态性可能与白种人患IVDD 的风险存在明显的关联趋势［39～41］。

IL-33 是一种组织来源的细胞因子，属于IL-1家族。它在内皮细胞、上皮细胞和成纤维细胞样细胞中广泛表达，在正常条件和炎症过程中都有表达，它的功能是在细胞或组织损伤时释放警报信号，以激活表达致癌抑制因子2（suppression of tumorigenicity 2, ST2，也称为IL-33R）受体的免疫细胞［42］。有基础研究指出，在人体退变髓核组织中，IL-33 的表达显著降低。此外，在人的原代髓核细胞中，过表达IL-33 可以增加细胞外基质aggrecan 和collagenⅡ的表达，抑制基质降解酶和凋亡相关基因的表达，还可以通过增加HIF-1α 的表达来增强aggrecan 和collagenⅡ的表达；但是，在抑制了IL-33的表达之后，HIF-1α 的表达被抑制，aggrecan 和collagenⅡ的表达也会降低。总之，IL-33 表达的改变可以通过调节HIF-1α 进而调节髓核细胞的基质降解和凋亡［43］。

5 小结与展望

目前，对于警报素的研究日益深入，警报素在IVDD 中扮演着重要角色。众多研究指出，由于椎间盘独特的结构，髓核可能是一个免疫豁免组织。然而，近期许多研究表明，巨噬细胞浸润和血管侵入可能是IVDD 的重要原因之一。警报素作为PAMP 和DAMP 的共同配体，更是在椎间盘的退变过程中发挥着重要的作用。相信在不久的将来，免疫因素是否在IVDD 过程中发挥着作用将会得到更好的回答。同时，针对警报素的进一步研究将会为IVDD 的治疗提供更好的思路和方法。