我国食品中动物源性成分检测标准研究进展

2024-06-03王恩辉张志然

中国标准化 2024年5期

王恩辉张志然

摘要：肉类食品掺假是影响我国食品质量安全的一个主要问题，其不仅损害消费者的身體健康，也冲击着消费市场的稳定秩序，因此动物源性成分检测具有十分重要的意义。目前我国常见的动物源性成分检测标准分为传统形态学检测标准、基于蛋白质组学的检测标准，以及基于基因（核酸）组学的检测标准。本文系统梳理了不同类别动物源性成分检测标准的特性，以期为检测机构和食品安全监管部门在方法选用与政策制定等方面提供理论支持。

关键词：食品，动物源性，成分检测，标准

DOI编码：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.05.034

0 引言

肉类食品掺假是影响我国食品质量安全的一个主要问题[1]。常见的掺假方式是将貂肉、狐狸肉和鸭肉等廉价肉混合，辅以淀粉、黄油、香精和羊（牛）油等添加物，制成高价的假“羊（牛）肉卷”“肉丸”以及“原切烤肉”食材[2-4]。肉类掺假带给消费者的危害主要是非肉食饲养动物如貂和狐狸体内包含多种病毒，未经检验检疫可能传播各种疾病并易引发过敏性症状，同时辅料中的香精以及羊（牛）油成分可能会导致人体味觉下降、消化不良，严重时造成肝功能受损；其次具有保健功能的食材如“阿胶”，常以马（牛）皮代替驴皮熬制，使产品营养价值降低的同时丧失其应有的功效[5]；此外，清真食品中含有猪源性成分以及用普通动物冒充野生动物等掺假问题也在一定程度上影响着消费市场秩序[6-7]。因此，动物源性成分检测对于维护食品质量安全和消费市场稳定具有重要意义。目前我国常见的动物源性成分检测标准可分为：传统形态学检测标准、基于蛋白质组学的检测标准，以及基于基因（核酸）组学的检测标准[8]。本文梳理了不同类别动物源性成分检测标准的特性，以期为检测机构和食品安全监管部门在方法选用和政策制定等方面提供理论支持。

1 传统形态学检测方法

传统形态学检测方法是利用显微镜将待测组分进行多倍放大，通过观察不同动物标志性的组织结构特征和细胞遗传学特性来进行动物源性的判断，例如鱼类具有特殊形状的沟纹和腔体，能和禽、畜类动物进行较好的区别[9]。目前显微检测方法能够检测肉粉、骨粉、血粉的动物源性大类，但不能对其进行定性分析，且结果随检测人的主观性有较大差异[10]。因此国内主要用该方法检测饲料中的动物源性成分（NY/T 3002—2016《饲料中动物源性成分检测显微镜法》）[11]，并未过多地用于食品中动物源性成分检测。

2 蛋白质组学的检测方法

目前食品中蛋白质组学方法是利用双向电泳方式达到源性成分检测的目的。该方法原理是基于蛋白质电荷和分子量特异性分离蛋白质，首先根据蛋白质的固有电荷，通过等电聚焦进行水平方向的分离，然后根据蛋白质的分子量，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行垂直方向的分离。水平分离反映了电荷或等电点的差异，垂直分离反映了分子量的差异，因此待测样品中的蛋白质组成会在两个方向上扩散排列达到分离多种动物源性蛋白质的目的。目前国内采用该方法的标准为SN/T 3033—2018《出口燕窝的分子生物学真伪鉴别方法实时荧光PCR法和双向电泳法》[12]。该方法利用蛋白质纯化试剂盒对燕窝样品进行蛋白质的提取、除盐与纯化工作，然后利用双向蛋白质电泳技术进行蛋白质分离，分离后对凝胶进行染色后在凝胶成像仪下进行观察，当分离后的电泳谱图，其水平方向等电点位于pH4.7～5.9的等位中间及偏酸性端，垂直方向分子量集中于30～50 KD时，若蛋白质呈现出同分异构特征，即分子量相同而等电点有差异的一串蛋白质点，则判断样品中检测出燕窝蛋白质[12]。该方法优点在于分辨率较高，不易受环境中气溶胶影响，假阳性较少，在数据库足够的情况下可分离多种动物源性蛋白，后期可结合质谱鉴定技术，进行大批量的动物源性成分鉴定。缺点在于对分子量质量极大（大于200 kD）和难溶性蛋白的分离较难，导致得到清晰的电泳谱图结果较难，对相关实验人员的操作要求较为严格。

3 基因（核酸）组学的检测方法

3.1 普通PCR结合测序方法

PCR聚合酶联式反应是利用特异性引物与待扩增DNA的模板来模拟DNA的天然复制过程，经由DNA模板变性、模板DNA与特异性引物的退火后复，以及DNA序列延伸三个过程的循环往复，实现待测DNA组分浓度的对数复制增长。PCR扩增后，将达到一定浓度和纯度的DNA样品经由凝胶电泳分离，然后对符合待测动物DNA片段分子量要求的凝胶区域进行切割后，将其中的DNA序列进行测定，测定出的DNA序列与数据库物种的DNA序列比对，序列吻合的则证明存在该动物源性成分。目前国内采用该方法的标准主要有GB/T 35918—2018《动物制品中动物源性检测基因条码技术 Sanger测序法》[13]、SN/ T 2978—2011《动物源性产品中鸡源性成分 PCR 检测方法》[14]、SN/T 3647—2013《鲨鱼动物源性成分检测方法 PCR法》[15]以及SN/T 3731—2013[16—17]部分系列标准。以SN/T 2978—2011为例，采用DNA提取试剂盒提取样品DNA后，利用特异性引物、碱基对以及DNA聚合酶等构建PCR反应体系，经PCR仪扩增后将扩增产物进行溴化乙锭-溴酚蓝凝胶电泳。实验过程要设置鸡源性DNA的阳性对照，以已知不含有鸡成分的样品提取的DNA为阴性对照，以灭菌水为空白对照同时进行凝胶电泳，实验在阳性对照出现131 bp左右的条带，阴性对照无该条带出现，空白对照无条带出现时，视为该实验成立。在实验成立的前提下，样品出现131 bp左右的扩增产物则判为可疑阳性，否则为阴性。将可疑阳性的PCR扩增产物进行核酸序列测定与 GEENBANK中鸡线粒体DNA相对应片段的序列比对，其片段大小正确，同源性达到98%以上，则确证含有鸡源性成分[14]。PCR结合测序方法的优点在于定性准确性较高，受环境中气溶胶影响相对较小，但凝胶电泳和测序花费时间较长，且凝胶电泳的核酸染料具有一定的生物毒性，实验人员需做好相关防护。

3.2 实时荧光定量PCR法

实时荧光定量PCR法是将荧光标記探针与特异性引物的一条DNA序列结合。该荧光探针初始状态两端分别有一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，在PCR酶联扩增反应前，荧光报告基团的信号会被淬灭基团直接吸收而无法被仪器检测到；在PCR酶联扩增进行的过程中，Taq DNA酶会将探针酶切，使荧光报告基团与淬灭基团分离，从而使荧光信号暴露被仪器检测到。理论上荧光信号会跟随PCR扩增的同时呈对数增加，实现荧光信号强度与DNA扩增产物浓度成正比的关系，进而达到定量的检测目的。目前国内动物源性检测标准主要采用该方法进行检测，畜类源性成分检测一般采用SN/T 3730—2013系列标准[18—25]与SN/T 2980—2011[26]检测貂、狗、狐狸、猪、猫、马以及牛和羊等成分；禽类源性成分检测一般采用SN/T 3731—2013部分系列标准[27-30]检测鸭、火鸡、鹌鹑等成分。这些标准其主要过程是利用DNA提取试剂盒提取待测样品的DNA，提取产物经过核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计检测浓度和纯度后，将DNA产物、碱基、荧光探针标记的引物以及酶等物质构建PCR反应体系，利用荧光PCR仪进行荧光实时定量PCR扩增，反应过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。以SN/T 3730.8—2013为例，以猪提取的DNA为阳性对照，以已知不含有猪成分的样品提取的DNA为阴性对照，以灭菌水为空白对照，当空白对照和阴性对照均无荧光对数增长且相应的Ct值大于40.0，同时阳性对照有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值小于30.0时，说明反应及质控有效，此时如果样品的Ct值小于等于35.0判定为阳性；如果样品的Ct值大于等于40.0则判定为阴性；如果样品的Ct值介于35和40之间，则重复实验一次，如重复实验Ct值仍为小于0，则判定被检样品为阳性；如再次扩增后Ct大于等于40.0，则判定被检样品为阴性[25]。与传统的PCR结合高通量测序的方法相比，该方法扩增反应后无须进行染色处理及电泳分离，可较为准确定量，且具有灵敏度高、自动化程度高的特点，适合大批量样品的检测工作。但由于部分食品在制作过程中被高温或油炸等操作破坏了其中的DNA结构，因此在检测时一般选择特异性明显的短DNA序列进行扩增[5]。这可能导致反应体易受实验室气溶胶污染环而出现假阳性，因此在实验前要确保实验室环境的消杀工作彻底。

3.3 膜芯片方法

膜芯片方法是利用尼龙材质或硝酸纤维材质膜体作为芯片基体的快速筛查技术[5]。其原理是将动物基因序列碱基对的其中一条作为探针固定在膜上，当待测样品的基因序列与该探针的基因序列互补时，该组分则会被保留在膜体芯片上，然后通过酶联反应与底物显色的方式，借助膜芯片识读仪读取结果。目前国内采用该方法的检测标准为GB/T35917—2018《常见动物源性成分快速测定膜芯片法》[31]。该方法优点在于当待测组分包含多种动物源性成分时，传统的荧光PCR检测方法的信号通道受限可能会增加检测时长，膜芯片技术则不受该问题影响，但由于膜体能够固定的基因序列较短，使用该方法时会出现假阳性的情况。该方法被检测机构或监管部门应用于市场快速筛查中。

4 结语

综上，国内食品中动物源性成分的检测是以普通PCR结合基因测序法以及实时荧光定量PCR法为主，以蛋白质检测法和膜芯片法为辅构建起来的标准检测体系。普通PCR结合基因测序的方法其定性准确性高，受气溶胶的影响相对较小，须要做好质控对照实验，耗时长、无法定量并具有一定的生物毒性；实时荧光定量PCR检测标准无需进行染色处理及电泳分离，可较为准确地定量，具有灵敏度高、自动化程度高的特点，但易受实验室气溶胶污染环而出现假阳性，须要做好实验室核酸的消杀工作；蛋白质检测标准基本不受环境中气溶胶影响，在数据库足够的情况下可分离多种动物源性蛋白，后期可结合质谱鉴定技术，进行大批量的动物源性成分鉴定，但对于大分子及难溶性蛋白的分离较差，且对人员操作要求较高；膜芯片技术适合快速筛查时使用，检测机构和食品安全监管部门可根据不同需求进行方法选择。

参考文献

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