四种不同产地核桃青皮中萘醌提取工艺优化*

李良哲，王 宇，罗心雨，姚 军，程煜凤

(1 新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830000；2 沈阳药科大学，辽宁 沈阳 110000)

核桃青皮，又名“青龙衣”，是胡桃科(Juglandaceae)胡桃属(Juglans)植物核桃(JuglansregiaL.)和核桃楸(Juglansmandshurica Maxim.)的未成熟外果皮[1]。始载于《开元本草》，其镇痛、治疡功效在《山东中草药手册》《救急方》等医药典籍中早有记载，民间也有将其泡水饮用起止痛之效的应用。核桃青皮占有核桃总质量的45%，是常见的农业废弃物之一。将核桃青皮这种农业废弃物通过绿色、环保、经济的方式“变废为宝”迫在眉睫[2]。现代研究表明，青龙衣中含有丰富的化学成分，包括醌类、黄酮类、二芳基庚烷类、酚酸类等[3]，具有良好的抗菌、抗肿瘤[4]、镇痛[3]、抗氧化[5]等多种药理活性。青龙衣中萘醌的提取分离方法一般是，先使用有机溶剂通过浸渍、热回流、超声等方式提取，再通过大孔吸附树脂以及硅胶柱色谱进行多次分离[6]。超声波提取具有提取温度低、提取率高、提取时间短等[7]优点，并且在提取过程中对有效成分损伤小、损失小[8]。紫外-可见吸光光度测定核桃青皮中的萘醌类化合物，检测时间比高效液相色谱法少，是一种高效快速的测定含量的方法。本试验以四种不同产地核桃青皮作为研究对象，采用超声波辅助提取核桃青皮中的萘醌类化合物，比色法测定其提取率，考察4个单因素对核桃青皮萘醌类化合物得率的影响，通过正交设计试验优化提取过程，为核桃青皮的有效开发利用提供可行的方法。

1 实 验

1.1 实验材料与试剂

四种不同产地(新疆、东北、安徽和陕西)的核桃青皮；1，8-二羟基蒽醌标准品(含量>98%)，Sigma-Aldrich公司；无水乙醇、氢氧化钾均为分析纯。

1.2 仪器与设备

AB135-S型十万分之一电子天平，瑞士梅特勒公司；UV-2550紫外-可见分光光度计，日本岛津；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；KQ-500DE超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；高速万能粉碎机，天津泰斯特FW135 /FW177；电热鼓风干燥箱，上海-恒科学仪器有限公司

1.3 实验方法

1.3.1 标准曲线的制备

参考文献[9]的标准曲线制备方法并做相应修改。精密称取1，8-二羟基蒽醌(含量>98%)0.01 g，溶于60%乙醇，置于50 mL容量瓶中，混匀并定容至刻度。用移液管精密移取上述制备的溶液0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL置于25 mL容量瓶中，精密加入1 mL 5% KOH溶液和60%乙醇至刻度。使用UV-2550紫外分光光度计扫描300～700 nm处的光谱。

1.3.2 核桃青皮萘醌类化合物提取率的计算

根据标准曲线计算提取物的浓度，根据以下公式计算提取率。

式中：c为萘醌类化合物的浓度，mg/mL；V为提取液总体积，mL；m为核桃青皮粉的质量，g。

1.3.3 四个单因素试验对萘醌类化合物提取率的影响

为探究四个不同因素对萘醌类化合物提取率的影响大小，对每个因素都进行了五个不同水平[8]的考察，乙醇浓度的单因素：20%、40%、60%、80%、100%；料液比的单因素：1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80(g/mL，下同)；超声温度的单因素：40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃；超声时间的单因素：30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，分别取1.0 g核桃青皮粉，初始条件为60%乙醇、料液比1∶60、超声温度60 ℃、超声时间120 min。按照1.3.1所述方法测定核桃青皮萘醌类化合物含量，3次平行试验，计算每次试验提取率。

1.3.4 正交设计试验

为探寻最佳提取工艺，在单因素实验的基础上，建立正交设计试验，测定核桃青皮中萘醌类化合物的含量，进行四因素三水平的正交试验，选用L9(34)正交表(见表1)。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Orthogonal test factor level table

1.3.5 四种不同产地的核桃青皮中萘醌类化合物的提取率

以正交试验最优条件提取四种不同产地核桃青皮中的萘醌类化合物，重复三次，求平均值。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制

选用300～700 nm波长范围的紫外-可见分光光度计对对照品进行扫描，最大吸收处的波长为540 nm(见图1)；在300～700 nm处对用5% KOH进行衍生化后的样品进行光谱扫描，最大吸收波长为540 nm(见图2)，所以选择检测波长为540 nm测定核桃青皮中萘醌类化合物。在540 nm下，根据1.3.1所示方法，得到萘醌标准曲线如图3所示。

图1 对照品储备液最大吸收Fig.1 Maximum absorption of control stock solution

图2 衍生化后样品最大吸收图谱Fig.2 Maximum absorption spectrum of samples after derivatization

图3 标准曲线Fig.3 Standard curve

2.2 乙醇浓度对提取率的影响

由图4可知，在40%乙醇条件下，提取率达最高值2.82%。在20%～40%乙醇浓度，浓度越高，溶液与萘醌类成分极性越接近，溶解度变大，提取量变大，乙醇浓度继续增大，溶剂与萘醌极性差距变大，提取量变小[10]。

图4 乙醇浓度对提取率的影响Fig.4 Ethanol concentration’s influence on extraction rate

2.3 料液比对提取率的影响

由图5可知，料液比1∶70提取率达最高值2.82%。当料液比超过1∶70，测定吸光度时，稀释的体积过大，单位体积中所含的萘醌类化合物的浓度过低，吸光度数值不断减小，萘醌类化合物提取率反而开始下降，所以选择最佳料液比为1∶70。

图5 料液比对提取率的影响Fig.5 Solid-liquid ratio’s effect on extraction rate

2.4 超声温度对提取率的影响

由图6可知，超声温度为70 ℃提取率达最高值1.75%。在40～70 ℃范围内，随着温度的升高，萘醌类化合物更易在乙醇中溶解，提取率不断增加。超声温度过高，乙醇挥发性增加，而且萘醌类化合物的化学性质也会改变[10]，所以选取70 ℃为最佳提取温度。

图6 超声温度对提取率的影响Fig.6 Temperature-related effects of ultrasound on extraction rate

2.5 超声时间对提取率的影响

由图7可知，在超声时间为120 min的条件下，提取率达最高值1.72%。随提取时间增加，萘醌类化合物在乙醇中溶解的越彻底，提取量越大。但提取时间超过120 min，提取率减少，这是由于当提取率趋近饱和时，萘醌类化合物的提取率不会随着时间的增加而增加[10]。

图7 超声时间对提取率的影响Fig.7 Effect of ultrasonic time on extraction rate

2.6 超声辅助提取核桃青皮中萘醌类化合物的正交结果

正交试验发现，A2B1C2D3的组合萘醌类化合物提取率最高，所以本试验筛选出的最优提取工艺为：40%乙醇，料液比为1∶50，超声时间为90 min，超声温度为70 ℃。根据表2与表3结果，各因素对萘醌类化合物提取率的影响乙醇浓度>料液比>超声温度>超声时间，对核桃青皮中萘醌类化合物提取具有参考意义。

表2 正交试验设计与结果Table 2 Orthogonal test design and consequences

表3 方差分析表Table 3 ANOVA orthogonal experiment

2.7 四种不同产地的核桃青皮中萘醌类化合物的提取率

由表4可知，东北地区的核桃青皮中萘醌类化合物提取率最高。不同地区环境不同，核桃成熟期不同，核桃青皮脱落时间不同，相同提取方法和条件下，萘醌类化合物提取率不同，可证明本试验是有意义的。通过比较不同地区的核桃青皮的萘醌类化合物的含量，寻找提取率最高的核桃青皮产地，为后续工作提供条件。

表4 不同产地的提取率(n=3)Table 4 Extraction rates in different places

3 结 论

采用正交试验法优化核桃青皮萘醌类化合物的提取条件，影响显著性顺序依次为乙醇浓度>料液比>超声温度>超声时间。最优工艺提取条件为：40%乙醇，料液比1∶70，超声时间90 min，超声温度70 ℃。四种不同产地的核桃青皮，东北的核桃青皮中萘醌类化合物提取率最高，达2.85%。本实验方法操作简便、成本较低，有效快速的提取及其测定核桃青皮中萘醌类化合物的含量，一定程度上提高了核桃青皮资源的利用率。