辽藁本种质创新、栽培繁育及分子生物学研究进展

樊 勇,李 旭,录亿隆,于春雷,杨正书,孙文松

(辽宁省经济作物研究所/辽宁省农业科学院药用植物研究所,辽宁 辽阳 111000)

辽藁本(Ligusticum jeholense Nakai et Kitag.),又叫北藁本、热河藁本,属于伞形科藁本属多年生草本植物[1],主要分布在我国辽宁、吉林、河北、山西、内蒙古等地,喜欢生长在林下、山坡地和灌木丛中[2]。 辽藁本以干燥的根或者根茎入药,在《神农百草经》中已有记载,在我国用于治疗风寒头痛和风湿性关节痛已有一千多年的历史[3]。 在中国药典(2020)中,只有辽藁本和藁本(Ligusticum sinense Oliv.)因其化学成分非常相似,用途和功效几乎相同而被列为藁本药材(LigusticiRhizoma et Radix),通常用于风寒感冒,巅顶疼痛,风湿痹痛的治疗[4],此外藁本药材还有抗菌和抗氧化的作用[5]。 目前在临床中医中,有超过100 种中成药使用藁本作为主要原料[6]。 从地理上看,辽藁本主要分布在我国北方,而藁本分布则较广泛,但与辽藁本的分布不重叠[7]。

前人关于人参、 枸杞、甘草等中药材植物的研究报道较多,但是关于辽藁本相关方面的研究则较少[8～10]。 随着分析测试技术的发展,前人对辽藁本已经从栽培技术、资源育种等基础研究开始,进一步深入到分子水平的探索。 本文章从辽藁本栽培技术、种质创新、种苗繁育、药用成分、分子生物学等方面进行了综述,总结了前人关于辽藁本的研究成果,为接下来的进一步深入研究提供新的思路和理论依据。

1 辽藁本生物学研究进展

药用植物的根、茎、叶、花是营养物质吸收、储备、运输及光合作用、种苗繁殖的重要功能器官,已有前人对辽藁本组织器官的生物学性状进行了研究,这为其野生资源的驯化利用和栽培技术的提高提供重要的参考价值。毕冬玲等通过石蜡切片等方法观察了辽藁本幼苗初生维管束系统的发育,发现子叶下部初生维管束向下发育形成下胚轴和根的维管束系统,上胚轴—苗的维管束系统向下发育与子叶迹相连后形成幼苗的初生维管系统[11]。肖智等通过电镜扫描技术对辽藁本的营养器官进行观察,发现实生苗根已经进入次生生长阶段,叶表皮细胞排列紧密,栅栏组织和海绵组织已经明显进行分化,深入分析了辽藁本营养器官在其生长、发育过程中的作用,为其资源的驯化和开发利用提供了理论依据[12]。

王萍莉等研究发现辽藁本与川芎、抚芎的花粉形态差异较大,但是仍然保留了藁本属花粉矩形类型的特点,认为川芎、抚芎是辽藁本的变种[13]。 于英等对辽藁本的物候期和生物学特性进行了调查,发现其在长春市的生育期为220 d 左右,将物候期分为返青期、营养生长期、孕蕾期、开花期、果期、枯萎期,并对株高、叶面积、花序、根部等农艺性状进行了分析,为辽藁本的驯化和人工栽培提供了理论依据[14]。

2 辽藁本栽培技术研究进展

随着科研人员对辽藁本野生资源引种、驯化的推进,国内已经陆续开始了辽藁的本人工栽培。 随着种植面积的逐渐扩大,中药材加工企业对辽藁本高效栽培技术标准提出了更高的要求。 前人研究了辽藁本不同栽培技术模式对产量和品质的影响,为建立科学的栽培管理模式提供了理论基础,为实现长远的社会经济效益提供保证。李俊等从整地、土壤处理、种子处理、种苗繁育、田间管理等方面阐述了辽藁本的关键栽培技术,为其高产高质种植提供技术支撑[15]。 于英等研究发现在仿野生栽培模式下光照强度更有利于辽藁本植株生长,能够促进根部干重、挥发油含量提高,增加经济效益[16]。 国微等对不同栽培环境下辽藁本根部产量性状进行了研究,发现密林栽培条件下辽藁本产量最低,大田栽培产量最大,而疏林中产量居于二者之间[17]。 刘芳等对不同栽培密度下辽藁本的根重、根长、株高等性状进行分析,发现种植密度在(25～30 cm)×60 cm 时植株的综合性状最好[18];于英等研究发现种植密度为(25～30 cm)×60 cm 时,根部性状、药性较好,与刘芳等的研究结果相一致[19]。

武晓林等对辽藁本营养元素吸收和分配规律研究发现,营养生长期植株对氮、磷、钾的吸收量增加,特别是对磷、钾的吸收,种子成熟后氮肥吸收较多[20]。 李雪研究发现氮磷钾不同配方施肥对根的鲜重、干物质量、阿魏酸含量、藁本内酯含量影响显著,结合产量和品质考虑认为氮磷钾低水平施肥效果较好[21]。 由于病虫害发生的轻重影响植株的生长状态,所以病虫害的防治效果对药用植物的生长势和药用部位产量的提高具有重要意义。 刘莹等系统阐述了辽藁本白粉病、根腐病、红蜘蛛、蚜虫等病虫害的发生规律和综合防控措施,将病虫害的发生降低到最小[22]。 赵桂敏等较为全面的从种苗繁育、田间管理、病虫害防治、收货与加工方面阐述了辽藁本高效栽培技术,对积极推动当地中药材和特色蔬菜产业发展起到重要作用[23]。 从长远发展来看,建立稳定、生态、高产的辽藁本种植基地,是满足市场需求、解决资源紧缺、提高药材质量的重要途径[24]。

3 辽藁本种质资源创新研究进展

随着辽藁本药材需求的逐年增加,人工开采使其野生资源遭到严重破坏,迫切需要加快辽藁本种质资源创新和新品种选育,以满足生产的需要。 辽藁本野生资源在东北和内蒙古地区较为丰富,但是随着药农的采挖野生资源日益减少,培育适合人工栽培的家种品系,配合相关的高效栽培技术可以促进辽藁本产业的长足发展[3]。野生资源作为重要的育种材料,植株性状、生育期、抗逆性等特征差异较大,通过收集、驯化、评价鉴定和种质创制研究,选育出性状相对稳定的适用于规模化种植的栽培品种。 张博等对吉林市通化地区辽藁本野生资源分布、生长情况、群落特征等进行统计调查,为野生资源的开发利用、人工驯化奠定基础[25]。 杨旭等对引种的辽藁本资源进行初选,对筛选出的两个优良株系的综合性状进行评价,掌握其生长发育特性,为新品种的进一步选育提供依据[26]。 赵桂敏等将辽藁本野生种经过单株选择,选育出药食同源的新品种“抚香叶芹1 号”,嫩茎叶可以作为野菜使用,根部可以入药,具有较高的经济价值[27]。辽藁本野生资源的开发利用和种质创新为其规模化生产提供优良的栽培品种,进而推动了产业的长远发展。

4 辽藁本种苗繁育技术研究进展

随着辽藁本人工栽培面积的逐年扩大,需要大量优质种苗满足生产需要,所以提高辽藁本的种苗生产繁育技术关乎产业的发展。 前人研究了辽藁本种苗繁育的不同方法,为更好地实现规模化栽培提供技术支撑。

4.1 种子繁育与扦插繁育技术

辽藁本种苗以种子繁育居多,将种子与一定量的细沙混匀撒播在床面上,用耙子搂平后稍加镇压,再铺1 ～1.5 cm 的松针,一般7 ～10 d 左右出苗[23]。 种苗移栽一般在早春或者晚秋进行,选择一年或者多年生种苗以20 cm×20 cm 栽植在床面上,定植深度一般为10～15 cm,栽植时不要窝根[15]。 尹航等对辽藁本地上茎进行了扦插研究,发现茎节中下部带有成熟叶片的节间扦插后生根能力较强[28]。

4.2 组织培养繁育技术

组织培养作为一种无性繁殖技术,不仅可以对种质资源进行很好的保存,还可以对优良品系进行快速大规模扩繁,通过组织培养可以对种苗繁育进行严格管控,实现种苗标准化生产。 贾凌云等以辽藁本嫩叶为外植体,在MS 培养基的基础上添加2,4-二氯苯氧乙酸、6-糖基氨基嘌呤、肌醇等物质诱导愈伤组织,愈伤组织长得快且长势好[29]。 李雪等将辽藁本未成熟种胚作为外植体进行诱导培养、不定芽增值、不定根培养及炼苗等试验,建立起组织快繁体系,为种苗标准化繁育奠定理论基础[30]。

5 辽藁本种子质量研究进展

目前,随着各种中药材产品的开发利用,中药材种植面积逐年扩大,对种子质量的检验和规范提出更高的要求。 种子质量的有效管控,为辽藁本的规模化种植提供可靠的种源保证。 李雪等对辽藁本种子的生物学特性进行研究,制定了种子检验的方法,并发现光照、黑暗条件对辽藁本种子萌发没有显著影响[31]。 张天静等对辽藁本种子进行了分级标准研究,规定了一级、二级、三级种子的农艺性状标准,从源头保障了辽藁本种子质量[32]。 孙永娇等年分析了辽藁本种子对其它作物种子萌发的感化作用,发现辽藁本种子的水浸液、乙醇提取物、挥发油及提取挥发油后溶液,对辽藁本、沙蒿、芹菜、白菜种子的萌发均存在不同程度的抑制作用,为辽藁本种子种苗繁育过程中种子萌发处理提供理论依据[33]。

6 辽藁本药用化学成分研究进展

辽藁本的主要药用活性成分为阿魏酸和藁本内酯,由于其植物基源复杂,在不同地区种植的药用成分含量也有所差异[34]。 文章阐述了辽藁本发挥药效的物质成分,为更好地开发利用辽藁本药用资源提供科学的理论依据。 李雪等报道辽藁本3 年生植株不同生育期根部干重、阿魏酸和藁本内酯的含量均高于2 年生植株,阿魏酸和藁本内酯含量在3 年生植株盛花期达到最大[35]。 刘莹等研究了根际土壤因子对辽藁本药用成分的影响,发现过氧化氢酶、酸性磷酸酶活性、速效磷、有机质含量对辽藁本阿魏酸和藁本内酯的含量有极显著影响[36]。 卢星原等采用大孔树胶、硅胶柱色谱和葡萄糖凝胶柱色谱,从辽藁本干燥根茎及根部分离鉴定到阿魏酸、异阿魏酸、川陈皮素、3’,4’3,5,7-五甲氧基黄酮、香草酸、柑橘黄酮、胡萝卜苷,其中3’,4’3,5,7-五甲氧基黄酮、香草酸、胡萝卜苷首次从辽藁本中鉴定到[37]。 孙佳明等从辽藁本地上部分分离鉴定到β-谷甾醇、补骨脂素、蔗糖、槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷、胡萝卜苷、山柰酚-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷、山柰酚-3-O-( 2″,4″-二-反式-对-羟基桂皮酰基) -α-L-鼠李糖苷,其中补骨脂素、槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷、山柰酚-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷、山柰酚-3-O-( 2″,4″-二-反式-对-羟基桂皮酰基) -α-L-鼠李糖苷首次分离鉴定到[38]。 为了进一步分析辽藁本发挥药效的主要化学物质,张博利用色谱手段分离鉴定了辽藁本地下部位和地上部分单体,其中,Z,Z’-6,6’,7,3’α-二聚藁本内酯、川芎三萜、蔗糖、胡萝卜苷在地下部位首次获得,蔗糖、胡萝卜苷、β-谷甾醇在地上部分首次获得,鉴定了这些物质的化学结构,并且发现地上部分提取物的抗氧化活性强于地下部分[39]。 韩秋菊等改进了藁本药材中黄酮分离纯化工艺,使黄酮的回收率达到81. 88%,纯化率达到71.09%,经验证纯化后藁本黄酮的抗氧化性显著高于未纯化前[40]。

前人对辽藁本与其它藁本属植物有效药用成分进行了分析,为藁本类药材的鉴定和质量评价提供理论依据。戴斌等对辽藁本与新疆藁本进行了研究,发现二者药材性状、显微组织、化学成分薄层色谱均有各自的鉴定特征,共药理实验表明新疆藁本抗真菌作用强于辽藁本[41]。郑虎占研究发现新疆藁本的阿魏酸和肉豆蔻醚含量高于辽藁本,两种藁本属植物含有16 种相同的化合物,并且解痉镇痛作用几乎相近[42]。 张迎春等对辽藁本、藁本、新疆藁本等七种藁本样品中挥发油成分进行分析,鉴定出82 种成分,其中共有成分为14 种,各样品鉴定出的成分占总挥发油的平均值为94%,且不同样品挥发油对大鼠离体血管的舒张活性明显不同[43]。 Li 等结合气相色谱—质谱和化学模式识别分析对辽藁本和藁本的挥发油成分进行了分析,发现肉豆蔻醚、新蛇床内酯含量的差异变化对鉴定辽藁本和藁本具有较高的价值[44]。

7 辽藁本分子生物学及根内微生物研究进展

7.1 分子生物学研究进展

核糖体DNA 内部转录间隔区(ITS)片段较短,易于PCR 扩增,技术操作简便,在中药材亲缘关系分析、药材真伪度鉴定等方面被广泛应用。 王丽芝等通过 ITS2 序列构建系统进化树分析了辽藁本、藁本、川芎的亲缘关系,发现三者之间亲缘关系极为亲密,首次提出了辽藁本可能是川芎种质野生资源的观点[45]。 Liu 等利用ITS2 序列和二级结构信息鉴定43 种藁本药材的真伪,将藁本药材从掺假或者替代药材中鉴定出来,为藁本药材的市场监管提供依据[46]。 李雪等利用不同的DNA 条形码序列对辽藁本、新疆藁本及藁本混伪品进行鉴定,发现NrITS 和ITS2 的DNA 序列用于鉴别两种藁本与混伪品效果较好,为辽藁本栽培过程中种源选择和药材质量鉴定提供理论基础和保证[47]。

指纹图谱的构建常用来鉴定不同的物种,目前中药材中三七、人参等已经构建了DNA 指纹图谱[48,49],但是辽藁本还是利用化学成分来构建指纹图谱,如瞿昊宇等通过对15 个辽藁本药材和饮片的HPLC 指纹图谱进行评价,发现二者的指纹图谱基本一致,说明辽藁本药材炮制后保留了原有的质量属性[50],乔萍等测定了辽藁本的HPLC 指纹图谱和有效成分含量,通过PLS-DA 法标记出了5 个差异的有效成分,为辽藁本质量优劣的评价提供了高效的分析方法[51]。

7.2 根部微生物研究进展

宏基因组测序技术是指对要研究的微生物基因组总和进行分析,可以准确且详尽的得到想要研究的植物根际或根内微生物的群落结构、多样性信息、不同微生物之间的演化关系,同时宏基因组测序还能让我们了解到微生物的功能等信息[52,53]。

植物内生菌与健康植株长期共存生长,不会侵染植物表现出病害症状,研究分离植物内生菌,发掘广谱性内生菌生物制剂对植物病害防治有重要意义。 张芳芳等对辽藁本内生菌进行了分离、纯化和鉴定,发现筛选出ZHAB63 菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),对11 种常见病菌拮抗率达到50%以上,通过对该菌株的16SsrDNA 基因序列进行测序,揭示其对病菌的拮抗机理,并对其生长的培养基和发酵条件进行了优化[54]。根腐病作为辽藁本根部和根茎部病害,严重发生时会造成植株大面积死亡,张天静等从辽藁本根腐病植株中分离纯化得到茄镰孢菌(Fusarium solani)菌株,利用10 种药剂对其菌丝抑制效果进行筛选,发现1. 8%辛菌胺醋酸盐、10%苯醚甲环唑、80%乙蒜素、3%噻霉酮的防治效果较好[55]。

8 辽藁本研究展望

8.1 品种选育方面

随着辽藁本药材需求的逐年增加,种植户对其新品种的选育提出迫切要求,由于辽藁本种质资源分类比较混乱,没有标准的资源评价体系,性状稳定的品种较少,育种工作进度缓慢,制约了产业的发展。 辽藁本品种选育和资源保护是其产业发展的技术核心,要通过多种技术手段开展资源鉴定与评价工作,加快资源驯化和品种选育,建立辽藁本新品种特异性、一致性和稳定性(UDS)测试指南,为辽藁本品种权的制定、维护提供技术支持,促进育种者对新品种选育的积极性,推动中药材种质创新和新品种选育的新发展。

8.2 优质种苗繁育方面

种苗做为农业生产的前端产业,是辽藁本产业的“芯片”,并关乎其相关产业的发展质量。 近年来随着辽藁本栽培面积的逐年扩大,市场对优良种苗的需求增加,但是大多数种植户还处于自繁自用的模式,机械化程度低、育苗规模小,种苗的质量参差不齐,专业化育苗市场发育尚不完善,导致中药材市场出现质量混乱、药效下降等现象。 要加快辽藁本产业的持续发展,就需要建立大型育苗工厂,引进标准化、规范化、规模化的现代育苗技术,制定种苗繁育技术标准和质量追溯体系,才能实现整个产业的健康发展。 政府要进行引导和规范,培养辽藁本等中药材育苗方面的专业人才,建立中药材种苗繁育体系,推广应用相关技术标准,推动相关企业带动产业的进一步发展。

8.3 分子生物学方面

随着分子生物学的发展,辽藁本在物种分子鉴定、遗传多样性分析等方面的研究逐步展开,但是仍有许多分子方面研究的空白需要解决。 例如其它中药材已经陆续开展DNA 指纹图谱的构建,辽藁本还是以药用成分构建指纹图谱,应加强开展辽藁本DNA 指纹图谱的构建,提高对辽藁本不同产地、不同品种、药材真伪的鉴定标准。 利用基因组和转录组测序技术对药用成分形成相关基因进行挖掘,并对其功能进行验证,揭示药用物质合成的作用机理,为种质创新提供理论依据。

8.4 组学研究方面

随着组学研究技术的发展,组学分析在中药材研究中发挥重要作用,要开展转录组和蛋白质组等组学在辽藁本研究中的应用,以揭示辽藁本在不同生长条件下药用成分形成的分子机制,为药用品质的提高奠定基础。转录组学从分子水平分析差异表达基因对中药材抗病、抗逆、育种、药用成分合成的调控作用,李铭铭通过地黄转录组测序挖掘了干旱胁迫条件下关键基因,并对其功能进行了分析,初步阐述地黄响应干旱的分子机制[56]。蛋白组学是研究某一特定条件下植物组织中所有蛋白质的表达量和功能,以揭示蛋白质在代谢合成调控网络中的作用。 刘子修对盐胁迫诱导下夏枯草的差异蛋白进行了筛选和表达分析,并结合差异基因表达模式研究,探讨了逆境条件夏枯草下药用成分积累和品质形成的内在机制[57]。 应采用不同组学技术对辽藁本进行资源选育、栽培技术研究、加工炮制、药用成分分析等方面研究,提高辽藁本的药用品质,完善其质量控制体系。

8.5 根基微生物研究方面

目前,随着对根际微生物研究的不断深入,根际微生物对植物生长、发育的影响机理也被进一步发掘和证明。探讨根际微生物菌群结构的多样性对于研究微生物与植物生态环境关系、微生物资源的开发利用有着重要的理论和现实意义。 探究辽藁本不同种植年限根际微生物的变化规律,有助于阐明辽藁本逐年种植过程中微生物的分布、组成、代谢等变化规律,揭示微生物种群的变化失衡趋势及微生物与根际环境的互作关系,为进一步进行土壤改良、缓解辽藁本连作障碍提供理论依据。