N端B细胞表位缺失的兔出血症病毒VP60蛋白的表达及其免疫原性

刘维龙 胡波 范志宇 魏后军 仇汝龙 宋艳华 陈萌萌 葛雷 熊富强 王芳

摘要：  本研究將A3C单抗识别的VP60蛋白NTA区域作为识别标记，设计一系列编码VP60 NTA区域重叠多肽的基因序列并连接于pGEX-4T-1载体，确定A3C单抗识别的精确表位。然后构建重组质粒Bacmid-  VP60△A3C  ，将Bacmid-  VP60△A3C  转染Sf9昆虫细胞，得到重组杆状病毒rBac-  VP60△A3C  。RT-PCR、HA、IFA和Western Blot鉴定结果表明，重组蛋白VP60△A3C在Sf9细胞中高效表达，电镜观察显示其形态和结构与兔出血症病毒VP60蛋白类似。将重组蛋白VP60△A3C以每只200 μg免疫2月龄RHDV血清阴性的新西兰兔，免疫后14 d，以兔出血症病毒WF株攻毒新西兰兔。结果表明，免疫组无死亡，而对照组全部死亡。本研究结果为制备表位缺失的兔出血症亚单位疫苗奠定了基础。

关键词：  兔出血症病毒； VP60蛋白； B细胞表位； 免疫原性

中图分类号：  S855.3    文献标识码： A    文章编号：  1000-4440（2024）03-0508-06

Expression of rabbit hemorrhagic disease virus VP60 protein with B cell epitope deletion in N terminus and its immunogenicity in rabbit

LIU Wei-long1，2， HU Bo1，3， FAN Zhi-yu1，2，3， WEI Hou-jun1，3， QIU Ru-long1，3， SONG Yan-hua1，3， CHEN Meng-meng1，3， GE Lei1，3， XIONG Fu-qiang3，4， WANG Fang1，2，3，4

（1.Institute of Veterinary Medicine， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory for Veterinary Bio-Product Engineering， Ministry of Agriculture， Nanjing 210014， China； 2.Xizang Agricultural and Animal Husbandry University， Linzhi 860000， China； 3.GuoTai （Taizhou） Center of Technology Innovation for Veterinary Biologicals， Taizhou 225300， China； 4.College of Veterinary Medicine， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract：  This study used the NTA region of the VP60 protein recognized by A3C monoclonal antibody as a recognition marker， designed a series of gene sequences encoding overlapping peptides in the VP60 NTA region， and connected them to the pGEX-4T-1 vector to determine the precise epitopes recognized by A3C monoclonal antibody. Then recombinant plasmid Bacmid-  VP60△A3C   was constructed. Bacmid-  VP60△A3C   was transfected into Sf9 insect cells， and recombinant baculovirus rBac-  VP60△A3C   was obtained. The identification results of RT-PCR， HA， IFA， and Western blot showed that the recombinant protein VP60△A3C was highly expressed in Sf9 cells. Electron microscopy observation showed that its morphology and structure were similar to those of rabbit hemorrhagic disease virus VP60 protein. The 2-month-old RHDV serum negative New Zealand rabbits were immunized with recombinant protein VP60△A3C at a rate of 200 μg per rabbit， and New Zealand rabbits were challenged with rabbit hemorrhagic disease virus WF strain after 14 days. The results showed that there were no deaths in the immune group， while all deaths occurred in the control group. The results of this study lay the foundation for the development of epitope-deleted subunit vaccine of rabbit hemorrhagic disease.

Key words：  rabbit hemorrhagic disease virus （RHDV）； VP60 protein； B cell epitope； immunogenicity

兔出血症（Rabbit hemorrhagic disease， RHD）是由兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus， RHDV）引起的高发病率和死亡率的烈性传染病[1]。RHDV分为GI.1（RHDV1）和GI.2（RHDV2）2种基因型，分别引起兔出血症1型和兔出血症2型，2种基因型病毒之间交叉保护性低[2-4]。自2020年GI.2型RHDV在中国出现以来[5]，2种基因型RHDV在中国处于共同流行态势。GI.1型RHDV主要感染2月龄以上兔，幼兔感染后不发病，但可带毒，并在群体传播中发挥重要作用[6]，表明感染幼兔是该病重要的传染源之一。

RHDV的衣壳蛋白（VP60）可以自组装形成35～40 nm的病毒样颗粒（VLPs）。同时，VP60可在机体内诱导产生中和抗体，是RHDV的主要免疫保护性抗原，也是宿主免疫防御 RHDV 的主要靶标，在病毒诊断和国内外疫苗设计中起重要作用[1]，但现有疫苗和抗体检测方法均无法鉴别疫苗免疫和病毒感染。鉴于GI.1型RHDV感染幼兔的带毒和病毒传播特点，因此构建一种基于VP60蛋白的表位标记疫苗并配套相应的表位抗体检测技术用于感染兔群的检测，是区分疫苗免疫和病毒感染的可行方案。前期我们发现A3C单抗识别的VP60蛋白N端B细胞表位具有强免疫原性但不具有中和活性，因此将该表位位点作为一种识别标记，构建一种A3C识别表位缺失的VP60蛋白，在昆虫细胞中表达并研究其VLPs形成能力，可为构建兔出血症表位缺失的标记疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌种和细胞  重组质粒pFastbac1-  VP60  （GI.1型  VP60  ）、Sf9 昆虫细胞、大肠杆菌 DH10 Bac 由本实验室保存； BL21（DE3）感受态购自北京全式金生物技术有限公司。

1.1.2 主要试剂  DNA Marker DL 2 000、ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit试剂盒、ECL显色试剂盒、1.1×PCR mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司，FBS购自GIBCO公司，山羊抗小鼠FITC-IgG、山羊抗小鼠HRP-IgG购自Biosharp生物科技公司，VP60单克隆抗体A3C、1D4由本实验室制备，Taq高保真酶、转染试剂 Lipofectamine 3000和Grace培养基购自Invitrogen公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 表达质粒的合成  在前期模糊定位非中和单抗A3C识别VP60 NTA区域的基础[7]上，设计一系列VP60 NTA区域重叠多肽的基因序列并连接于pGEX-4T-1载体（表1）。

1.2.2 单抗A3C识别表位的鉴定  将合成的重组表达质粒pGEX-4T-1-  VP60 NTA1  、pGEX-4T-1-  VP60 NTA2  、pGEX-4T-1-  VP60 NTA3  、pGEX-4T-1-  VP60 NTA4  分别转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态，阳性菌经0.5 mmol/L IPTG诱导表达后获得重组蛋白pGEX-4T-1-VP60 NTA1、pGEX-4T-1-VP60 NTA2、pGEX-4T-1-VP60 NTA3、pGEX-4T-1-VP60 NTA4，经SDS-PAGE电泳后，转印至PVDF膜上，经5%脱脂乳封闭后，以识别VP60 NTA区的单抗A3C为一抗，羊抗鼠HRP-IgG（1∶10 000）为二抗，进行Western Blot鑒定，确定A3C单抗识别的精确表位。

1.2.3 引物合成  A3C识别表位缺失株构建引物及一系列鉴定引物由北京擎科生物科技有限公司合成（表2）。

1.2.4 缺失A3C识别表位的重组转移载体的构建  以本实验室保存的重组质粒pFastbac1-  VP60  为模板，以  VP60△A3C  -F/  VP60△A3C  -R引物进行PCR反应，扩增缺失A3C识别表位的  VP60  基因。PCR反应程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，65 ℃ 15 s，72 ℃ 7 min，30个循环；72 ℃ 5 min。将PCR反应产物于1.2%琼脂糖凝胶进行鉴定，120 V电泳30 min后，回收PCR阳性产物，使用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit试剂盒对PCR产物进行连接、转化，用pFastBac-F/pFastBac-R引物进行扩增及测序鉴定，获得正确缺失A3C识别表位的杆状病毒重组转移载体pFastbac1-  VP60△A3C  。

1.2.5 缺失A3C识别表位的重组穿梭载体的构建  将重组转移载体pFastbac1-  VP60△A3C  转化含有穿梭载体的大肠杆菌DH10Bac，使用蓝白斑筛选法，将大肠杆菌DH10Bac涂布于含3种抗性的平板上（含50 μg/ml Kanamycin、7 μg/ml Gentamicin、10 μg/ml Tetracycline、100 μg/ml X-gal和40 μg/ml IPTG），37 ℃恒温培养2 d后，挑取白色阳性单菌落纯化培养后提取质粒。以M13-F/M13-R进行PCR反应，获得重组穿梭载体Bacmid-  VP60△A3C  。

1.2.6 细胞转染  使用转染试剂 Lipofectamine 3000将重组穿梭载体Bacmid-  VP60△A3C  转染Sf9昆蟲细胞，结束后每12 h观察细胞状态，待细胞出现间隙增大、折光性增强、形态变圆等病变特征时收集细胞及其培养物，以1 000 r/min离心5 min收获上清液即为rBac-  VP60△A3C  原液（F1代病毒）。

1.2.7 mRNA的检测  收集接种rBac-  VP60△A3C  的Sf9昆虫细胞样品，采用Trizol法提取感染细胞内总RNA，反转录为cDNA后，以  VP60  -F/  VP60  -R引物进行RT-PCR扩增，鉴定mRNA的存在。PCR程序为：95 ℃ 5 min，然后进入循环95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 5 min。将PCR反应产物于1.2%琼脂糖凝胶120 V电泳30 min后，紫外灯下观察结果并拍照。

1.2.8 间接免疫荧光试验（IFA）  预先将Sf9细胞在24孔细胞板上培养至密度为85%～90%，每孔接种等量的重组杆状病毒rBac-  VP60△A3C  ，同时以野生型毒株感染Sf9 细胞作阴性对照。在感染Sf9细胞24 h后，弃去培养液，PBS 洗涤2次，加入提前-20 ℃冷藏的甲醇和丙酮混合成的固定液，4 ℃作用1 h；PBS洗涤3次，加入PBS稀释的1D4单抗（1∶200），37 ℃孵育90 min，PBS洗涤3次后，加入PBS 1∶50倍稀释的山羊抗小鼠FITC-IgG，黑暗条件下37 ℃孵育1 h，PBS洗涤3次，荧光显微镜观察并拍照。

1.2.9 SDS-PAGE和Western Blot检测  将重组杆状病毒rBac-  VP60△A3C  接种Sf9细胞，72 h后收获细胞培养物，反复冻融3次后，取上清液，等比例加入Loading buffer处理后进行蛋白质电泳，结束后将凝胶半干转印至PVDF膜上，5%脱脂乳37 ℃ 封闭2 h，PBST洗涤3次后，以1D4单抗（1∶1 000）为一抗，羊抗鼠HRP-IgG（1∶10 000）为二抗，进行Western Blot鉴定。

1.2.10 血凝效价测定  参照中华人民共和国农业行业标准NY/T 572-2016兔病毒性出血病血凝与血凝抑制试验方法[8]进行。

1.2.11 电镜观察  对获得的重组蛋白表达产物以红细胞吸附释放法[9]进行纯化并超速离心，蛋白质样品VP60△A3C经生理盐水重悬后取少量置于铜网静置2 min，加入2%磷钨酸染液，利用透射电镜观察重组蛋白样品并拍照。

1.2.12 免疫保护性研究  将纯化的VP60△A3C蛋白稀释至200 μg/ml，免疫兔出血症病毒抗原和抗体均阴性的2月龄新西兰兔5只，每只颈部皮下注射1 ml，同时以5只接种生理盐水的新西兰兔作为对照组。免疫后14 d，分别颈部皮下注射1 000 LD50的兔出血症病毒，攻毒后7 d内每12 h观察试验兔并记录。

2 结果与分析

2.1 A3C单抗识别表位的鉴定

对VP60 NTA1、VP60 NTA2、VP60 NTA3、VP60 NTA4 4个蛋白进行SDS-PAGE电泳，转印PVDF膜后，以单抗A3C为一抗，羊抗鼠HRP-IgG为二抗进行Western Blot鉴定，结果显示，VP60 NTA1、VP60 NTA2和VP60 NTA4 3个蛋白有阳性条带，而VP60 NTA3无条带（图1），由此确定单抗A3C识别的精确氨基酸位点为DGMDPG，对应的核苷酸序列为GACGGCATGGATCCTGGT。

2.2 重组转移载体和重组穿梭载体的鉴定

以重组质粒pFastbac1-  VP60  为模板扩增得到缺失A3C识别表位的杆状病毒重组转移载体pFastbac1-  VP60△A3C  ，大小约6 000 bp（图2A）。经测序验证后将pFastbac1-  VP60△A3C  转化大肠杆菌DH10Bac，提取阳性质粒用引物M13-F/M13-R进行PCR鉴定，扩增产物大小约为4 000 bp，而阴性对照扩增产物大小约为300 bp，表明成功获得重组穿梭载体Bacmid-  VP60△A3C  （图2B）。

2.3 RT-PCR鉴定重组病毒的表达

按Trizol法提取接种rBac-  VP60△A3C  的Sf9细胞总RNA，以  VP60  -F/  VP60  -R为引物进行RT-PCR扩增，鉴定mRNA。结果显示，出现大小约为 1 800 bp的电泳条带（图3），大小与目的基因近似，表明  VP60△A3C  基因得到表达。

2.4 间接免疫荧光检测（IFA）

将rBac-  VP60△A3C  感染Sf9细胞24 h后，以1D4单抗（1∶200）为一抗，羊抗鼠FITC-IgG（1∶50）为二抗进行IFA检测。结果显示，感染rBac-  VP60△A3C  的Sf9细胞可见很强的特异性荧光，而阴性对照无特异性荧光出现（图4），说明VP60△A3C蛋白有效表达。

2.5 SDS-PAGE和Western-Blot鉴定

将rBac-  VP60△A3C  感染Sf9细胞72 h后，以1D4单抗（1∶1 000）为一抗，羊抗鼠HRP-IgG（1∶10 000）为二抗，进行Western Blot鉴定。PVDF膜经显色后出现相对分子质量为6×104的条带（图5），与预期一致，结果表明VP60△A3C蛋白有效表达。

2.6 表達蛋白的血凝效价测定

将rBac-  VP60△A3C  感染Sf9细胞4 d后，以96孔“U”形血凝板对表达产物进行血凝效价测定。结果表明，VP60△A3C蛋白能凝集人1% O型红细胞悬液，血凝效价为1∶4 096，表明VP60△A3C蛋白高效表达。

2.7 电镜观察

电镜观察结果表明，VP60△A3C蛋白可形成大小为35～40 nm、形态和结构与兔出血症病毒VP60蛋白类似的VLPs，说明缺失A3C识别表位不影响VP60蛋白病毒样颗粒的组装（图6）。

2.8 免疫原性检测

将VP60△A3C蛋白进行纯化后免疫RHDV血清阴性的新西兰兔，14 d后进行攻毒，检验重组蛋白对家兔的免疫保护作用。结果显示，以红细胞吸附释放法获得纯化的VP60△A3C蛋白，经蛋白质定量后以每只200 μg的剂量免疫新西兰兔，然后以RHDV WF株攻毒，免疫组家兔获得100%保护，而注射生理盐水的对照组家兔全部死亡（表3），表明VP60△A3C蛋白具有良好的免疫原性。

3 讨 论

目前尚未建立天然RHDV的体外培养系统，病毒难以在体外稳定增殖，因此国内外新型疫苗的研究主要将VP60蛋白作为RHDV的免疫保护性抗原分子。目前  VP60  已在杆状病毒、酵母、大肠杆菌、乳酸杆菌、痘病毒等多种系统中表达并开展免疫原性研究[10-15]，且以杆状病毒表达系统研究较多。另外也有利用杆状病毒表达系统进行以VP60为载体研究外源表位免疫原性的报道[16]。该系统表达效率较高，可以实现外源蛋白的全悬浮细胞培养表达，且已有商品化疫苗产品上市。

现有研究结果表明VP60蛋白可分为NTA区、S区和P区，NTA区位于VP60蛋白的N端[17]。VP60蛋白形成的VLPs结构中，N端位于VLPs内部，而C端位于外表面，是受体结合区域和中和表位所在区域[17]，且VP60氨基酸的一些改变并不影响VLPs的形成[16，18]。本实验室在前期研究中发现了VP60 N端存在一个免疫原性强但不具有中和活性的B细胞表位，由单抗A3C识别，并已进行了模糊定位[7]。本研究在此基础上首先精确定位了单抗A3C识别的B细胞表位，构建了该表位缺失的重组杆状病毒rBac-  VP60△A3C  ，其感染Sf9细胞后表达的缺失A3C识别表位的VP60蛋白可自组装成VLPs，表明该表位的缺失不影响病毒样颗粒的形成。将表达蛋白纯化后免疫新西兰兔，可以完全保护家兔免受GI.1型强毒株的感染，表明表位缺失的VP60蛋白依然具有良好的免疫原性，是一种优良的兔出血症候选疫苗分子。

感染幼兔是GI.1型兔出血症重要的传染源之一，由于目前无法区分GI.1型疫苗免疫和病毒感染，因此难以在养殖兔群中完全清除被RHDV感染的幼兔。本研究构建了基于表位缺失的VP60蛋白，可用于制备一种基于表位缺失的兔出血症标记疫苗，后续建立检测该表位抗体的ELISA检测技术，有望实现GI.1型兔出血症疫苗免疫和病毒感染的鉴别，为兔出血症的防控提供新的技术产品。

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（責任编辑：成纾寒）