基于网络药理学方法预测定喘汤治疗慢性阻塞性肺疾病的作用机制及验证研究

徐国睿 冯湘仪 曲 怡 王建波 刘海涛 马永钢 张立德

(1 辽宁中医药大学针灸推拿学院,沈阳,110847; 2 中医脏象理论及应用教育部重点实验室,沈阳,110847;3 辽宁中医药大学,沈阳,110847; 4 解放军总医院京西医疗区,北京,100144)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)是一种常见的、可预防的和可治疗的疾病,其特征是持续的呼吸道症状和气流受限,这是由气道和(或)肺泡异常引起的,常见于接触大量有毒颗粒或气体等原因[1]。由于世界人口老龄化程度加剧,COPD的发病率及死亡率也在逐年递增,且COPD的并发症较多,如呼吸衰竭、肺源性心脏病等,所以COPD是世界3大死亡原因之一。世界银行进行的一项研究估计,2010年中国COPD病例数为25 658 483例,2020年为42 527 240例,2030年为55 174 104例,中国COPD的诊断率(被诊断为COPD的患者人数除以通过流行病学研究发现的COPD病例数)在23.61%～30.00%之间。接受门诊治疗的COPD患者的比例约为50%,而入院率在8.78%～35.60%之间。一项覆盖7个省份的全国性调查发现,COPD患者的正规医疗率仅为7.9%,这就要求改善COPD的预防和管理。中国COPD患者仍有大量的卫生服务需求未得到满足[2]。现代医学治疗COPD主要以抗炎、抗感染、化痰、解痉平喘、扩张支气管等手段为主,其中激素治疗效果显著,但会引起一系列不良反应,且会影响体内的多巴胺及5-羟色胺含量,影响人体情绪,诱发抑郁、焦虑等,且长时间应用激素会导致骨质疏松、胃应激性溃疡等疾病。近些年很多研究表明,中西医结合治疗COPD可减少西药带来的不良反应,并协同增强其药物作用[3]。定喘汤源自《摄生众妙方》,其药物组成为：麻黄、白果、桑白皮、紫苏子、半夏、杏仁、款冬花、黄芩、甘草。方中麻黄宣肺散邪以平喘,白果敛肺定喘而祛痰,共为君药,一散一收,既可加强平喘之功,又可防麻黄耗散肺气。紫苏子、杏仁、半夏、款冬花降气平喘,止咳祛痰,共为臣药。桑白皮、黄芩清泄肺热,止咳平喘,共为佐药。甘草调和诸药为使。诸药合用,使肺气宣降,痰热得清,风寒得解,则喘咳痰多诸症自除。因此,本研究采用网络药理学方法分析定喘汤治疗COPD的作用机制,并通过细胞实验进行验证,旨在为中医药治疗COPD的研究提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 靶点筛选

1.1.1 定喘汤活性化合物的筛选 本研究通过中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)数据库(https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)检索定喘汤中各味中药(白果、半夏、甘草、黄芩、款冬花、麻黄、桑白皮、杏仁、紫苏子)的有效成分,并根据口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%、类药性(Drug-likeness,DL)≥0.18为筛选条件进行筛选,最后得到各个药物有效成分。

1.1.2 定喘汤靶点预测分析 利用TCMSP数据库中的化合物相关靶点(Related Targets),利用UniPort数据库(https：//www.uniprot.org/),选择参数为人类物种(Human)和已验证的(Reviewed)数据库,得到标准名称(Targets Symbol),经过以上数据库得到的靶点即为中药有效成分相关靶点。将各个单味药靶点进行整合即为定喘汤靶点。

1.1.3 药物靶点ID转换 UniProt数据库(http：//www.uniprot.org/)是国际公认和标准化的蛋白质序列和注释数据的综合资源数据库。在UniProt数据库中对药物靶点进行ID转换。

1.1.4 COPD靶点获取 疾病靶点基因数据采集于GeneCards数据库(https：//www.genecards.org/)、在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM,https：//omim.org/)、治疗靶点数据库(Therapeutic Target Database,TTD)(https：//db.idrblab.org/ttd/)、PharmGkb数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)、DrugBank数据库(https：//www.drugbank.ca/),以COPD为关键词检索,采集COPD对应的靶点基因。将定喘汤成分靶点与COPD靶点取交集,通过R语言绘制韦恩图。

1.1.5 中药-成分-交集靶点网络构建 通过交集靶点推测出中药有效成分,构建中药有效成分-交集靶点网络,利用Cytoscape V 3.8.0软件对有效成分-交集靶点网络进行分析,节点(Node)代表中药所含有效成分与交集靶点;边(Edge)代表中药成分与交集靶点之间联系,根据中药有效成分与交集靶点之间连接情况筛选定喘汤治疗COPD关键成分。

1.1.6 蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)与核心靶点筛选 在STRING数据库(https：//string-db.org/)导入交集靶点进行PPI网络分析,将研究物种设定为“人”(“Homo Sapiens”),最低互动得分设置为高等置信度[“highes confidence(0.900)f],其余参数为默认设置,获得PPI网络。然后利用Cytoscape V3.8.0软件对PPI网络进行拓扑分析,选取度(Degree)、介数中心度(Betweenness Centrality)和中心性(Closeness Centrality)都大于中位值的靶点为定喘汤治疗COPD的作用机制核心靶点。

1.1.7 富集分析 通过R4.1.2,引用“clusterProfiler”“org.Hs.eg.db”“enrichplot”“ggplot2”包,进行基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析。做出GO term生物过程(Biological Process,BP)、细胞组分(Cellular Component,CC)、分子功能(Molecular Function,MF)三合一柱状图。通过R 4.1.2,用“clusterProfiler”“org.Hs.eg.db”“enrichplot”“ggplot2”“pathview”包,进行京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,并绘制KEGG富集柱状图。

1.1.8 核心化合物-核心靶点分子对接验证 选择核心基因,在PubChem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)找到影响该基因的药物成分2D结构,用Chem3D软件分别进行3D优化。通过UniProt寻找到对应的蛋白质,然后用PMV-1.5.6软件进行去水加氢等预处理。使用AutoDockTools-1.5.6软件将筛选得到的化合物与目标蛋白进行对接。

1.2 实验验证

1.2.1 细胞 本实验选用人Ⅱ型肺泡上皮细胞(Human TypeⅡ Alveolar Epithelial Cells,HAECⅡ,货号：CP-H209,普诺赛,批号：CP-H209),细胞生长于含10%胎牛血清的培养基中,培养基额外加入双抗,培养箱环境设置为37 ℃,5%CO2,每48 h更换1次培养基,3 d传代一次,根据细胞生长状况,收集对数期生长细胞进行实验研究。在进行实验时,用胰蛋白酶-EDTA消化液消化3 min,接种于T25培养瓶,6孔板或96孔板中进行后续实验。

1.2.2 药物 定喘汤药物颗粒(辽宁中医药大学附属医院,批号：7100232882)。

1.2.3 试剂与仪器 罗斯韦尔公园纪念研究所-1640培养液(Roswell Park Memorial Institute,RPMI,格来赛生命科技,批号：SH30809.01),脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS,上海希格玛高技术有限公司,批号：L2654-1MG),磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Solution,PBS,武汉普诺赛生命科技有限公司,批号：WH0021G11),特级胎牛血清(赛默飞世尔科技,批号：FB25015),细胞活力检测试剂(Cell Counting Kit-8,碧云天生物技术,批号：C0037),青链霉素混合液(索莱宝,批号：No.P1400),胰蛋白酶-EDTA消化液(凯基生物,批号：KGY0012),Trizol裂解液(碧云天生物技术,批号：P1275601),引物设计合成(北京博迈德基因技术有限公司,批号：BMH89759),HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit试剂盒(康为世纪,批号：CW2582M),UltraSYBR Mixture生物试剂(康为世纪,批号：CW2601M),白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)人源检测试剂盒(北京诚林,批号：202105),白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)人源检测试剂盒(北京诚林,批号：202105);荧光定量PCR仪(ABI,美国,型号：7500 Fast Real-Time PCR),梯度PCR仪器(ABI,美国,型号：ABI Veriti梯度PCR仪器),超微量紫外分光光度计(Thermo Fisher,美国,型号：NanoDrop2000),微量冷冻离心机(Thermo Fisher,美国,型号：Sorvall ST 16R)。

1.3 方法

1.3.1 药物制备 取药物颗粒剂用热水混合,完全融化后等待10 min,将其旋转蒸发浓缩,条件为50 ℃,200 r/min,在真空冷凝干燥机中冻干处理48 h,将冻干物研磨成粉末制成冻干粉,取定喘汤冻干粉用适量超纯水溶解,制备成母液,再以0.22 μm滤器过滤除菌,放置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 给药方法 将HAEC2细胞培养于含10%胎牛血清及双抗的1640培养液,培养瓶置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱内培养,待细胞增殖汇合度至80%～90%进行传代。设正常对照组、LPS组、LPS+定喘汤(低、中、高)剂量组。将细胞接种于6孔/96孔板,待细胞增殖汇合度至70%～80%后,给予LPS(5 mg/L)刺激细胞12 h,随后加入不同浓度定喘汤冻干粉母液干预24 h。

1.3.3 检测指标与方法

1.3.3.1 CCK8法检测定喘汤对HAEC喘细胞增殖的影响 将细胞接种于96孔板中。在贴壁后造模组加入LPS(5 mg/L)刺激12 h,随后加入不同浓度定喘汤24 h。加入10 μL CCK-8再孵育,寻找合适的时间点。用酶标仪在450 nm波长处测定OD值。

1.3.3.2 定量分析 PCR(Quantitative PCR,qPCR)检测蛋白激酶B(Protein Kinase B,AKT)、环腺苷酸反应元件结合蛋白(cAMP Response Element Binding Protein,CREB)、B细胞淋巴瘤2(B Cell Lymphoma 2,Bcl-2)、髓样细胞白血病-1(Myeloid Cell Leukemia-1,Mcl-1)的mRNA表达将对数期生长的细胞接种在6孔板中,细胞在造模治疗结束后,每孔加入1 mL Trizol裂解细胞,随后使用萃取法提取总mRNA,逆转录为cDNA,用荧光定量PCR仪进行扩增,扩增条件：95 ℃,30 s;95 ℃,5 s;60 ℃,34 s,40个循环。扩增引物序列见表1,熔解反应按ABI 7500仪器设定条件进行。2-△△CT法对荧光定量PCR结果进行分析。

表1 引物序列设计

1.3.3.3 酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测细胞培养液中IL-1β与IL-6含量 收集细胞培养上清液,离心20 min(2 000～3 000 r/min、离心半径10 cm)进行细胞分泌物成分检测;标准品的稀释与加样;分别设空白孔,待测样品孔,在酶标板上待测样品孔中加标准品稀释液40 μL,然后再加待测样品10 μL;37 ℃温育30 min;洗涤5次;每孔加入酶标试剂50 μL;温育洗涤5次;每孔加入显色剂A,B各50 μL,振荡混匀,37 ℃避光显色15 min;每孔加入终止液50 μL终止反应;以空白孔调零,450 nm波长测量各孔OD值。

2 结果

2.1 定喘汤成分筛选 通过筛选最后得到中药有效成分相关靶点共274个,其中杏仁19个、紫苏子16个、白果21个、半夏13个、甘草92个、黄芩36个、款冬花22个、麻黄23个、桑白皮32个。

2.2 定喘汤与疾病靶点筛选 通过筛选最后得到14 789个有效成分,其中杏仁943个、紫苏子883个、白果1 568个、半夏1 302个、甘草2 506个、黄芩1 203个、款冬花1 088个、麻黄3 921个、桑白皮1 375个。去除重复,共有314个。在5个疾病数据库中对COPD相关靶点筛选,得到疾病相关靶点共有7 899个。其中GeneCards数据库6 369个、OMIM数据库353个、TTD数据库64个、PharmGkb数据库869个、DrugBank数据库244个。运用R语言得到药物与疾病的靶点交集共262个,并绘制韦恩图。见图1。

图1 COPD与定喘汤交集靶点韦恩图

2.3 中药-化合物-靶点-疾病网络构建 根据组成复方的中药、化合物、核心靶点以及疾病信息构建定喘汤的“中药-化合物-靶点-疾病”的网络构建图。可以看出定喘汤通过调控CDKN1A、SP1、EGFR、FOXO1、MAPK14、AKT1等实现多靶点-多化合物共同调控整个COPD的治疗过程。见图2。

图2 中药-活性成分-靶点-疾病网络

2.4 PPI构建 通过String数据库,获得PPI关系图。见图3。再对互作网络进行分析得出核心网络。见图4。依据Degree值由高到低排序依次为CDKN1A(42)、SP1(40)、EGFR(38)、FOXO1(38)、MAPK14(36)、AKT1(36)、MAPK3(36)、NR3C1(34)、JUN(34)、CCND1(34)、MAPK1(32)、MAPK8(32)、CTNNB1(26)、CEBPA(24)、NFKBIA(24)、ESR1(22)、STAT1(22)、RELA(22)、MYC(20)、TP53(20)、FOS(18)、RB1(18)、HIF1A(18)、STAT3(18)、PPARA(16)。

图3 COPD-定喘汤交集靶点PPI网络

图4 靶点核心网络

2.5 GO富集及KEGG通路分析

2.5.1 GO富集分析 通过GO富集分析散点图。见图5。分析得出基因参与的BP为对外源性刺激的反应、对氧化应激的反应、对营养水平的反应、对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、对化学应激的细胞反应、衰老、对金属离子的反应、对乙醇的反应、对活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的反应等;CC为膜筏、膜微区、囊泡腔、转录调节复合物、胞浆囊泡腔、质膜筏、小窝、蛋白激酶复合物、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物、细胞周期蛋白-依赖性蛋白激酶全酶复合物等;MF为脱氧核糖核酸-结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ-特异性DNA-结合转录因子结合、DNA-结合转录激活活性、DNA-结合转录激活活性,RNA聚合酶Ⅱ-特异性、血红素结合、四吡咯结合、核受体活性、配体-活化转录因子活性、转录辅调节因子结合、转录辅激活因子结合等。

图5 GO富集分析气泡图

2.5.2 KEGG通路分析 通过富集分析发现,定喘汤治疗COPD信号通路主要包含炎症相关通路、病毒感染通路、免疫信号通路、代谢过程等通路的改变,以P<0.05,Count值为标准,取排名靠前,制作柱状图。见图6。相关度最高的通路包括：脂质与动脉粥样硬化、PI3K-AKT信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、人巨细胞病毒感染、乙型肝炎、MAPK信号通路、化学致癌-受体激活、丙型肝炎、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、前列腺癌等。本研究共得出信号通路180条,本实验将研究目标定位在与炎症反应相关的PI3K-AKT信号通路。见图7。

图6 KEGG通路富集分析柱状图

图7 PI3K-AKT信号通路示意图

2.6 分子对接 将影响核心基因AKT1该基因的药物成分quercetin与kaempferol分别与AKT1的蛋白质进行分子对接。见图8。

图8 定喘汤成分与核心靶点分子对接(AKT1-kaempferol),(AKT1-quercetin)

2.7 定喘汤抑制LPS介导的细胞毒性 实验结果表明,HAECⅡ诱导细胞炎症反应后,LPS组CCK8数值显著降低,显示了LPS的细胞毒性反应,而定喘汤可以显著增加HAEC可细胞状态与活力,差异有统计学意义(P<0.05),其中定喘汤中剂量组效果最为显著。见表2。

表2 不同组别HAEC效细胞CCK8表达

2.8 定喘汤干预AKT、CREB、Bcl-2、Mcl-1的mRNA

表达 实验结果显示,与空白组比较,LPS组HAEC组细胞AKT、Mcl-1 mRNA含量显著增高,CREB、Bcl-2含量显著降低(P<0.05);与LPS组比较,定喘汤中剂量组能够显著降低AKT、Mcl-1的mRNA表达,升高CREB、Bcl-2的mRNA表达(P<0.05)。见表3。

表3 各组别AKT、CREB、Bcl-2、Mcl-1的mRNA表达

2.9 定喘汤减轻HAEC轻细胞IL-1β与IL-6炎症介质的分泌 实验结果表明,LPS组与空白组比较,IL-1β比、IL-6含量显著增高,差异有统计学意义(P<0.05);与LPS组比较,定喘汤中、高剂量组能够显著降低HAEC降细胞液中IL-1降、IL-6含量,差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 不同组别HAECⅡ细胞液IL-1β,IL-6含量

3 讨论

COPD已经成为全球性卫生问题,也是导致我国居民肺部疾病死亡的主要原因之一,国内外相关研究均已证实烟草烟雾、空气污染会导致肺组织内环境出现氧化应激,不仅造成气道氧化损伤,使得气道炎症反应加剧,还会因此引起气道重塑、气流受限,导致肺功能受损。

定喘汤起源于《摄生众妙方》,含有黄芩、麻黄、紫苏子、甘草、桑白皮、款冬花、白果、杏仁、半夏9味中草药,具有清肺降气、化痰清热的功效[4]。方中炙麻黄与白果两药合用既能增强平喘之功又能防麻黄辛散太过耗伤肺气,一散一收、相反相成共为君药[5]。麻黄主升,杏仁主降,升降相合。紫苏子、杏仁还能润肠通便,肺与大肠相表里,大肠通,肺气亦通。桑白皮、黄芩二者可制约麻黄之温。杏仁、紫苏子、款冬花、半夏皆能降气平喘化痰止咳,还可防麻黄过于耗散[6]。

本研究通过网络药理学方法检索出定喘汤与COPD的相关靶点共262个,通过构建中药-化合物-靶点-疾病网络、PPI网络、GO富集分析和KEGG富集通路分析可以预测出定喘汤通过AKT1、STAT1、RELA、MYC、FOS、HIF1A、PPARA等基因,调控PI3K-AKT、Lipid and atherosclerosis等相关信号通路,从而减轻气道炎症反应、调节免疫功能来达到治疗的目的。其中GO富集分析表明,定喘汤治疗COPD机制可能包含如下方面。1)氧化应激：在COPD中存在氧化和羰基应激,尤其是在急性加重期。COPD患者的肺泡巨噬细胞更加活跃,并以超氧化物自由基和过氧化氢的形式释放更多的ROS[7]。ROS通过激活核因子κB(Nuclear Factor Kappa B,NF-κB)和激活蛋白-1(Activating Protein-1,AP-1)产生气道炎症反应[8-9],导致炎症介质的产生。ROS还通过加强组胺的作用直接招募炎症细胞,如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞,从而损伤肺组织并引起炎症反应[10]。同样,COPD患者的外周血嗜酸性粒细胞细胞释放更多的ROS,尤其是在急性加重期间。COPD中氧化应激和羰基应激的标志包括硝基酪氨酸浓度升高[11]。氧化应激可在多种水平上激活NF-κB信号通路,COPD患者的NF-κB表达和激活增加,并与气流受限相关[12]。2)气道炎症：炎症细胞是超氧化物最重要的产生者,组蛋白乙酰转移酶(Histone Acetyltransferase,HAT)从组蛋白核心解螺旋DNA转录,而组蛋白脱乙酰酶(Histone Deacetylase,HDAC)通常的功能是通过羧基化和硝化过程(通过硝基酪氨酸的形成)缩回组蛋白核心的DNA以停止转录,ROS降低HDAC的活性,并可能增加HDAC的活性,ROS诱导HDAC2减少可能是糖皮质激素敏感性降低的原因[13],作为调节HAT和HDAC的结果,ROS引起炎症介质基因如肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、IL-1和IL-8、NF-κB和AP-1的过量表达,导致炎症细胞进一步募集,特别是嗜中性粒细胞和肺泡中的巨噬细胞产生更多的ROS/RNS,给肺部带来更多的氧化负担。

PI3K及其下游介质在COPD的肺和气道重塑过程中上调[14]。COPD进展过程中PI3K信号介导的差异表达意味着它们在这种病理条件下的动态调节。PI3K信号的任何失调不仅会激活控制转录因子的产生,这些转录因子调节关键的炎症介质,如精氨酸酶-1和IL-10,并抑制促炎标志物的产生[15],还会影响肺泡免疫细胞,导致免疫反应过度[16-17]。这种异常增强的免疫反应导致慢性炎症反应。这是COPD的特征。PI3K间接激活AKT,AKT是一种关键的蛋白激酶,在COPD中具有广泛的下游靶点。AKT活化与PI3K活化相关,与磷酸酶和张力蛋白同源物(Phosphatase and Tensin Homolog,PTEN)活性负相关。重要的是,PTEN在COPD患者的气道上皮细胞和外周肺组织中下调。此外,吸烟后ROS生成下调PTEN,增强AKT磷酸化,反之亦然。支气管上皮细胞中PTEN水平的降低也增加了单核细胞趋化蛋白1(Monocyte Chemoattractant Protein-1,MCP-1)和IL-8趋化因子、IL-6和其他炎症介质的产生和分泌,通过增强的PI3K信号转导促进慢性炎症反应[18-19]。

ROS引起上皮细胞膜的脂质过氧化,损害膜功能并增加细胞的渗透性[20],从而诱导组织损伤。由脂质过氧化反应形成的丙烯醛和4-羟基-2-壬烯醛(4-hydroxyl-2-nonenal,4-HNE)等活性醛会对上皮细胞造成损害,这些对气道上皮的损伤降低了上皮对吸入的氧化剂和其他损伤的保护能力,加剧了炎症反应[21]。在正常生理状态下,Ⅱ型肺泡上皮细胞(TypeⅡ Alveolar Epithelial Cells,AECⅡ)主要通过分泌肺泡表面活性物质来维持肺泡表面张力[22]。在肺泡上皮细胞被有害因素刺激时,AECⅡ可增殖分化为I型肺泡上皮细胞,修复受损的肺泡结构。因此,人们普遍认为AECⅡ是肺组织内具有干性功能的肺泡上皮细胞[23]。据研究发现,在肺气肿患者肺组织分离的AECⅡ细胞中,DNA损伤及修复功能出现明显异常[24-25],表明AECⅡ参与了肺气肿表型患者肺泡结构的破坏过程。细胞凋亡是COPD重要的发病机制之一,其作用增强将导致肺结构细胞数量减少及功能障碍,常成为炎症反应、氧化应激等致病机制作用的共同路径[26]。所以,本次选用AECⅡ为实验细胞。

本实验结果表明,定喘汤通过AKT1来调控AKT活化,进一步影响PI3K活化,使支气管上皮细胞中的炎症介质(IL-1β,IL-6)显著减少,达到抗炎的作用。

综上所述,本研究基于网络药理学与实验相结合的方式,通过对定喘汤各成分与COPD的复杂网络进行研究,初步阐释了定喘汤治疗COPD的主要药物成分、相关靶点以及有关通路,可以通过调整炎症反应和炎症介质等发挥治疗作用。本文从分子对接技术和体外抗炎活性实验2个方面验证,使研究结果具有指导意义,为中医药治疗COPD的研究提供科学依据。

利益冲突声明：无。