基于网络药理学和分子对接探讨胃复春治疗慢性浅表性胃炎作用机制

俞雯雯，康年松，岑迎东，王丹，傅厚道

1. 余姚市中医医院，浙江 余姚 315400

2. 浙江理工大学生命科学与医药学院，浙江 杭州 310018

3. 宁波市第二医院，浙江 宁波 315010

慢性浅表性胃炎（CSG）是一种常见的消化系统疾病，可发展为慢性萎缩性胃炎（CAG），甚至存在癌变风险[1-2]。临床常通过胃黏膜保护制剂、质子泵抑制剂等药物治疗CSG，但此类药物长期使用会增加胃肠道营养物质吸收、胃肠道黏膜增殖、骨代谢异常和感染等多种风险[3]。胃复春（WFC）具有健脾益气、活血解毒的功效，对治疗CAG、胃十二指肠溃疡、CSG等消化道疾病疗效确切，且安全性良好[4-6]，但关于WFC 治疗CSG 的具体生物学机制尚不明确。本研究运用网络药理学方法探讨WFC治疗CSG的作用机制，并运用分子对接技术进行验证，为后续WFC 治疗CSG研究提供更多参考。

1 材料与方法

1.1 药物活性成分筛选及潜在靶点获取通过中药系统药理数据库与分析平台（TCMSP）（https：//tcmsp-e.com/tcmsp.php）及中药综合资源数据库（TCMID）（http：//119.3.41.228：8000/tcmid/）收集WFC（红参、香茶菜、枳壳）的主要成分，并以类药性（DL）≥0.18%、口服利用度（OB）≥30%或OB 为HIGH、DL 为YES 为条件筛选出药性较好的活性成分[7]，并通过Cytoscape 3.7.2绘制中药-活性成分网络图。通过TCMSP 数据库及SwissTargetPrediction 网站（www.swisstargetprediction.ch）搜索药物活性成分对应的靶点，并通过UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）进行靶点信息比对和基因名校正，限定基因来源为人源性。

1.2 疾病相关靶点获取通过检索GeneCard 数据库（https：//www.omim.org/）及OMIM 数据库（https：//www.genecards.org），以“Chronic Superficial Gastritis”为检索词进行筛选。通过合并2个数据库搜索得到的疾病靶点与药物靶点进行映射获取交集靶点，利用韦恩在线网站（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）做交集靶点韦恩图，采用Cytoscape3.7.2 软件将结果进行可视化，构建药物-活性成分-交集靶点网络图。

1.3 蛋白质互作网络（PPI）构建将交集靶点导入STRING 数据库（http：//string-db.org/cgi/input.pl）构建PPI，将结果导入Cytoscape 3.7.2，借助网络分析工具，以选取连接度和结合分值为可视化参数，设置统计信息生成样式为环形布局，作靶标蛋白互作信息图。借助Cyto NCA 插件中的Degree、Betweenness、Closeness 等参数筛选节点，将连接度大于等于2倍中位数的节点确定为核心靶点[8]。将核心靶点与对应的化合物一一对应，导入Cytoscape3.7.2 作图，以连接度值为筛选条件，选取排位靠前的有效成分，得到WFC治疗CSG的关键成分。

1.4 基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书数据库（KEGG）通路富集分析将关键靶点导入DAVID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）进行GO 和KEGG（https：//www.kegg.jp/kegg/）通路富集分析，获取关键靶点的相关生物学信息，并利用R 软件绘制气泡图。

1.5 活性成分和核心靶点分子对接从RCSB PDB数据库（https：//www.rcsb.org/）获取靶点蛋白的三维结构，筛选物种来源为人源，选择方法为X射线，分辨率在2.50 Å 以下，下载靶蛋白PDB Format 文件；从PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取成分化学结构，并用Chem3d 软件转化为mol2 格式；利用SYBYL-X 2.1.1 软件中的Surflex-Dock 对接程序将靶蛋白与成分进行对接，以验证成分-靶点之间的可能性。

2 结果

2.1 WFC 活性成分和潜在靶点获取见表1、图1。在TCMSP 及TCMID 中搜索WFC 活性成分，以DL≥0.18%、OB≥30%或OB 为HIGH、DL 为YES 为筛选条件，删除重复项，共得到30 个活性成分，除去未搜索到靶点的化合物，最终得到25 个药物活性成分（香茶菜主要成分OB 值及DL 值通过SwissADME 网站获取，网址为www.swissadme.ch）。通过TCMSP 数据库及SwissTargetPrediction 网站共获得519 个药物潜在靶点，利用Cytoscape 3.7.2 绘制中药-活性成分网络图。

表1 WFC主要活性成分

2.2 CSG 靶点获取见图2、图3。在GeneCards 数据库里共找到896 个与CSG 相关基因，在OMIM 数据库共找到88个相关基因。通过合并2个数据库找到的CSG靶点与WFC活性成分潜在靶点进行对比，利用韦恩在线网站寻找交集靶点，共得到137 个共同靶点。将WFC 活性成分与CSG 靶点交集靶点导入Cytoscape 3.7.2将结果可视化，并构建WFC活性成分-交集靶点网络图。

图2 韦恩图

图3 活性成分-交集靶点网络图

2.3 核心靶点互作图见图4、图5。将上述137 个交集靶点导入STRING 在线数据库，获取蛋白质相互作用信息，构建PPI。137 个目标靶点存在复杂的相互作用，共有137 个结点，2 461 条边，结点平均度值为35.9，结点度值的中位数为31，最大值为107，将结果导入Cytoscape3.7.2，共得到WFC 治疗CSG 的137 个靶点互作信息图，设置度的筛选值为2 倍平均数值72 至最大值107，从交集靶点PPI 网络筛选出核心靶点17 个，分别为白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF）、苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、抑癌基因53（TP53）、信号转导和转录激活因子3（STAT3）、表皮生长因子受体（EGFR）、原癌基因（JUN）、白细胞介素-1β（IL-1β）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（CASP3）、连环蛋白β 1（CTNNβ1）、鸡肉瘤病毒基因（SRC）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）3、热休克蛋白90α 型1（HSP90AA1）、缺氧诱导因子-1A（HIF1A）、环加氧酶2（PTGS2）等。根据度值大小，从核心靶点中筛选出10 个关键靶点，分别为IL-6、TNF、AKT1、VEGFA、TP53、STAT3、EGFR、JUN、IL-1B、CASP3。根据蛋白与蛋白的Degree 值绘制17 个核心靶点节点的条形图，将17 个核心靶点对应化合物进行网络构建。结果显示，以度值为筛选条件，前8 味成分为人参皂苷Rh2（Ginsenoside Rh2）、柚皮素（Naringenin）、14-乙酰基-耐阴午茶菜素b（14-acetylumbrosin b）、β-谷甾醇（β-sitosterol），川陈皮素（Nobiletin）、胡麻黄素（Pedalitin）、亚甲基苯甲酸（Amethystoicacid）、橙皮素（Hesperetin）。

图4 WFC靶标蛋白互作信息图

图5 WFC有效成分-核心靶点网络图

2.4 GO 分析将137 个交集靶点导入DAVID 数据库，并限定物种来源为人源，选择标记栏为 official gene symbol 进行检索，设定阈值以错误发现率（FDR）＜0.01 为前提，确定了338 个GO 条目。见图6。其中生物过程（BP）相关条目258 个，主要包括RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、信号转导及细胞凋亡过程的负调控等；分子功能（MF）相关条目49 个，主要包括蛋白质结合、同类蛋白结合、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）结合等；细胞组分（CC）相关条目31 个，主要包括细胞质、细胞质基质、细胞核等，分别取前10 条进行可视化分析。

图6 GO分析

2.5 KEGG 通路富集分析见图7。利用DAVID 平台的KEGG通路富集分析功能对WFC与CSG的137个交集靶点在信号通路中的作用进行分析，共得到166 条信号通路。根据FDR＜0.01筛选出141条信号通路。利用R-4.0.5 进行KEGG 通路富集可视化分析，通过相应通路基因数量、相应通路基因占总体基因的比率和FDR 来衡量KEGG 富集程度，筛选并确定其中20 条最具统计意义的通路，发现WFC 作用于CSG的靶点常见通路有癌症信号通路、脂质与动脉粥样硬化信号通路卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染信号通路等。

图7 KEGG通路富集分析

2.6 分子对接结果见图8、图9。利用Surflex-Dock 对接程序将PPI 网络中排名前8 的关键成分（人参皂苷Rh2、柚皮素、14-乙酰基-耐阴午茶菜素b、β-谷甾醇、川陈皮素、胡麻黄素、亚甲基苯甲酸、橙皮素）与排名前10的关键靶点（IL-6、TNF、AKT1、VEGFA、TP53、STAT3、EGFR、JUN、IL-1β、CASP3）进行分子对接。当得到分值越大，表示配体与靶蛋白受体结合越稳定，当分值大于5 时说明分子与靶点有较好的结合活性，分值大于7 则说明分子与靶点的结合构型具有强烈的活性[9-10]。结果显示，80 组分子对接平均分值为5.2，最高分值为11.8，表明筛选出的关键靶点与关键成分间具有较好的匹配度。

图8 分子对接热图

图9 部分活性成分-靶点分子对接模式图

3 讨论

CSG 是一种常见的消化系统疾病，由细菌、病毒、幽门螺杆菌（Hp）感染等原因引起，症状表现为不同程度的食欲减退、消化不良、反胃、恶心呕吐以及腹部不适等，严重影响患者日常生活。WFC 收载于《中华人民共和国药典》[11]，由红参、香茶菜、麸炒枳壳3味中药组成，对治疗CAG、胃十二指肠溃疡等消化道疾病疗效确切，且安全性良好[4]。本研究发现WFC 治疗CSG 的主要有效成分有人参皂苷Rh2、柚皮素、14-乙酰基-耐阴午茶菜素b、β-谷甾醇、川陈皮素、胡麻黄素、亚甲基苯甲酸、橙皮素等。人参皂苷Rh2是一种四环三萜类皂苷单体，为红参的主要有效成分之一，研究表明人参皂苷Rh2可调节巨噬细胞、自然杀伤（NK）细胞等免疫细胞功能及多种细胞因子分泌，又能抑制脂多糖（LPS）诱导的炎症反应[12]。β-谷甾醇为红参与枳壳的主要有效成分，其可降低Hp 感染的胃炎小鼠胃黏膜中Toll 样受体2（TLR2）、磷酸化核因子κB 抑制蛋白α（p-IKBα）、磷酸化细胞核因子（NF-κB p65）、磷酸化κB抑制蛋白激酶α（IKK-α）蛋白表达水平，改善Hp 感染性胃炎小鼠炎症和黏膜损伤，发挥胃保护作用[13]。川陈皮素为枳壳的有效成分之一，研究证实川陈皮素可以通过提高抗氧化活性及减少促炎细胞因子表达来发挥对乙醇诱导的小鼠急性胃损伤的保护作用[14]。柚皮素是一种黄酮类化合物，广泛存在于枳壳等多种中药中，具有较强的抗炎、抗氧化及抗癌功能，研究显示，柚皮素对胃癌治疗具有一定疗效[15]。枳壳中的橙皮素与柚皮素同属于黄酮类化合物，具有抗氧化和抗炎等多种生物学活性[16]。以上报道与本研究结果相互印证，表明运用网络药理学研究WFC 治疗CSG 的分子机制具有一定科学性。

由PPI网络图可知，WFC治疗CSG的关键靶点有IL-6、TNF、AKT1、VEGFA、TP53、STAT3、EGFR、JUN、IL-1β、CASP3 等，这些靶点主要与炎症和免疫调节等相关。AKT1 属于蛋白激酶超家族，在调节细胞代谢、生长、凋亡和生存方面具有重要意义，且具有致癌作用[17]。IL-6 的表达与炎症反应、Hp 相关胃肠疾病发展息息相关，它不仅能诱导炎症细胞的募集，还能刺激产生炎症介质，诱导炎症级联反应[18]。TNF 是促进Hp 感染、抑制胃酸分泌的关键性炎症因子，也是介导CSG 发病的重要因子[19]。覃乐等[20]研究发现香茶菜能减少IL-1β、IL-18、IL-6、TNF 等炎症因子的释放。人参皂苷Rh2 可明显降低IL-6、TNFα、IL-1β、一氧化氮合成酶（iNOS）和环氧化酶-抑制剂（COX2）表达，且对于引起炎症的MAPK 和NF-κB 的磷酸化起到阻断作用[21]。研究发现CSG患者多伴有Hp感染，磷酸化AKT表达水平在Hp模型组中显著升高[22]。VEGFA 也被称为血管通透性因子，具有较强的诱导血管渗漏的能力，其诱导的血管通透性增强是其在炎症和其他病理环境中发挥重要作用的基础。综上所述，WFC 可能通过多途径、多靶点抑制炎症反应，发挥治疗CSG作用。

KEGG通路富集分析结果显示，WFC治疗CSG的交集靶点主要富集在癌症信号通路、脂质与动脉粥样硬化信号通路等。现代研究发现，癌症信号通路涵盖范围较广，与磷脂酰肌醇-3-激酶-苏氨酸激酶（PI3K-Akt）、MAPK、核因子κB/STAT3（NF-κB/STAT3）信号通路等联系密切，可引起基因组损伤，化疗抵抗等反应[23]。网络药理学结果显示，CSG 与WFC 的交集靶点有42%存在于癌症信号通路上，表明WFC 对CSG 的干预作用可能与癌症信号通路息息相关。临床发现CSG患者大多检测出Hp阳性，Hp感染是非萎缩性胃炎向萎缩性胃炎发展，发生癌前病变和癌症的重要因素[24-25]。临床上Hp 感染慢性胃炎患者血清中TNF-α和IL-6水平升高，且血清中TNF-α和IL-6 表达水平与慢性胃炎的严重程度密切相关[26]。研究发现随着慢性胃炎病程的延长，Ⅱb 型早期胃癌的检出率有上升趋势[27]；刁卓等[28]研究表明TNF-α 在胃癌中的表达明显高于癌旁正常组织，并证明了胃癌中受体相互作用蛋白激酶3（RIP3）/TNF-α 通路上调介导了程序性细胞坏死。TP53又被称为p53，属于抑癌基因，与抗炎活动有关，p53 可以显著抑制小鼠原发性巨噬细胞 TNF-α 基因表达，降低血清TNF-α水平，发挥抗炎作用[29-30]。高尤亮[31]等研究发现，通过上调p53 的表达能够促进炎症细胞凋亡，抑制TNF-α 等炎症细胞因子表达，减轻胃黏膜症状。药理研究发现人参皂苷Rh2能通过抑制PI3K/AKT通路，激活p53 信号通路，进一步诱导癌细胞凋亡[32]。此外，Hp 感染不仅可以加剧脂质代谢紊乱，促进动脉粥样硬化斑块的形成，还可能加剧炎症反应和增加动脉粥样硬化的发生率[33]。分子对接结果初步验证了WFC 治疗CSG 的可靠性，分子对接结果显示，80 组分子对接平均分值为5.2，表明关键成分与关键靶点具有一定的结合活性，其中，14-乙酰基-耐阴午茶菜素b与STAT3的结合得分最高，具有重要的参考价值，可为后续进一步开展相关中药及成分研究提供数据支撑。

综上所述，WFC 中人参皂苷Rh2、柚皮素、14-乙酰基-耐阴午茶菜素b 等活性成分能够作用于IL-6、TNF、AKT1、VEGFA 等靶点，调控癌症信号通路、脂质与动脉粥样硬化信号等治疗CSG。