基于回顾性分析与网络药理学探讨中医治疗登革热的证治方药及可能机制

谢铱子，黄秀芳，黄慧婷，詹少锋，刘小虹，江勇（1.广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 1040；2.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 1040；3.广州中医药大学岭南医学研究中心，广东 广州 1040；4.广东省中医临床研究院，广东 广州 1040；.深圳市中西医结合医院，广东 深圳 18104）

登革热是感染登革病毒（Dengue Virus，DENV）引发的一种急性传染病，是全球传播最广泛的蚊媒传染病之一[1]。据世界卫生组织报道[2]，近几十年登革热发病率迅速升高，全球已有100多个国家发生过登革热疫情，美洲与东南亚等地区深受影响。中国2005年至2019年的登革热累计病例共达93 688例，且每年均有疫情，形势严峻[3]。但是目前尚未研发出抗登革病毒的药物，也缺乏可被广泛运用的登革疫苗，故登革热的治疗方案是一个亟需解决的全球性问题[4]。然而，中医对登革热却有独特的认识，认为登革热属于“湿温”“温疫”“暑疫”的范围，临床上也体现出了较好的疗效[5]。中医药治疗登革热具有较好的研究前景和较大的研究意义。

本研究采用回顾性分析与网络药理学的方法，聚焦中医对登革热的证治方药规律研究，并探索中药治疗登革热的可能机制。由于临床上登革热患者以普通登革热占大多数，故本研究立足于普通登革热患者，旨在为中医辨治普通登革热理论体系的完善提供数据支持，为普通登革热的新药研发提供思路。

1 研究资料

本研究纳入的研究对象为2014年1月1日—2020年12月31日在广州中医药大学第一附属医院住院治疗的普通登革热患者。本研究已通过广州中医药大学第一附属医院医学伦理委员会的伦理审查，编号为：JY【2021】081。

1.1 纳入标准（1）年龄在15～75岁之间；（2）符合登革热诊断标准[1]；（3）病历资料以登革热作为出院诊断中的西医第一诊断；（4）病历可完整获得。

1.2 排除标准（1）重症登革热患者；（2）合并有脑、心、肺、肝、肾等严重原发病；（3）合并有恶性肿瘤、血液系统、泌尿系统等系统原发病；（4）病历中重要资料缺失或无法获取。

2 方法学

2.1 证型规律挖掘与二次辨证搜集普通登革热患者的临床症状与舌脉等资料，参考《中医诊断学》[6]进行校正、统一，并统计频数。频率＞5%的症状、舌脉视为高频，导入SPSS 21软件中作系统聚类，其中聚类类型为变量聚类，聚类方法为最远邻元素，度量标准为Phi 4点关联。根据聚类分析所得证型，对普通登革热患者进行二次辨证，并计算证型的频数。本节分析在2位专家的指导下进行。

2.2 新方挖掘筛选出入院后72 h内有口服中药汤剂的普通登革热患者，以口服的第一条方药为准，建立普通登革热临床用药数据库。中药名称参考《中华人民共和国药典》2020年版[7]、《中药学》[8]以及《广东省中药材标准（第一册）》[9]进行规范、统一，例如黑枣更为大枣，藿香更为广藿香，生石膏更为石膏等。频数统计后筛选出频数＞15次的中药作高频中药。将高频中药导入SPSS 21.0软件中进行因子分析，并基于因子分析结果进行系统聚类。聚类类型为个案聚类，聚类方法为组间联接，度量标准为平方Euclidean距离。本节分析在2位专家的指导下进行。

2.3 中药活性成分及靶点获取中药成分从TCMSP数据库[10]获得，并以HERB数据库[11]和（或）已发表的文献研究[12]作为适当补充。根据DL＞0.18且OB＞30%的标准，筛出中药活性成分。基于中药活性成分，在TCMSP及Swiss Target Prediction数据库[13]中获取药物靶点，并借助Uniprot数据库[14]获得药物靶点的基因简称。

2.4 症状靶点搜集与交集靶点筛选基于“2.1”项下所挖掘的普通登革热的证型与症状，在SymMap数据库[15]、DisGeNET数据库[16]中搜集靶点。检索采用现代医学症状与中医学症状相结合的方式。通过R4.1.2软件对药物靶点与症状靶点取交集。

2.5 关键活性成分及靶点对比通过STRING数据库[17]与Cytoscape 3.7.2软件，构建交集靶点的蛋白互作（Protein-Protein Interaction，PPI）网络，并按度（degree）值由大到小排列，degree值越大代表其可能在中药复方治疗普通登革热中发挥关键作用。以前10位为关键靶点，构建“药方-活性成分-靶点-证型”网络，以degree值排前10位为关键活性成分及靶点。对不同证型药物的关键活性成分及靶点进行比较。

2.6 富集分析以P＜0.05为筛选标准，在微生信（http://bioinformatics.com.cn/）中对交集靶点进行GO功能富集分析（含BP、CC、MF分析）及KEGG通路富集分析。由于P值越小，显著性越高，故通过P值由小到大排序，对排位靠前的条目进行可视化。

3 结果

3.1 证型规律本研究共纳入420例普通登革热患者，聚类分析结果见图1。2位专家商讨后一致认为，当聚为3类时，各分类的内部症状无矛盾，且符合普通登革热的临床特点，具体结果详见表1。

图1 普通登革热症状聚类结果Figure 1 Clustering results of dengue symptoms

3.2 二次辨证对普通登革热患者进行二次辨证，结果显示，占比最高的证型为“风热夹湿，邪在卫气”证229例（54%），其次为“湿热伤络，邪侵营血”证175例（42%），而“肺脾气虚，余邪未尽”证占比最少，仅16例，占4%。

3.3 中药新方挖掘

3.3.1因子分析 共有301例普通登革热患者口服了中药汤剂。对其高频中药进行因子分析，经检验Kaiser-Meyer-Olkin（KMO）值为0.907，Bartlett的球形度检验P＜0.001，提示可进行因子分析。采用主成分分析方法，抽取特征值＞1的成分5个，累计方差贡献率74.958%，详见表2、图2。通过Kaiser标准化最大方差分析法将主成分进行旋转，在24次迭代后得到旋转成分矩阵图，选取载荷数绝对值＞0.5的变量，得到5个公因子，如表3所示。

表2 普通登革热高频中药公因子总方差解释表Table 2 Explanation for the total variance of common factors of high frequency Chinesemedicinals for dengue

表3 普通登革热高频中药公因子所包含的变量及载荷数Table 3 Variables and loads included in common factors of high frequency Chinesemedicinals for dengue

图2 普通登革热高频中药因子分析碎石图Figure 2 Gravel map of factor analysis of high frequency Chinesemedicinals for dengue

3.3.2公因子聚类 对因子分析所得的5个公因子作聚类分析，结果见图3。聚为3类时，各分类中药数量适中，用药逻辑比较符合临床，故将新方结果总结于表4。

表4 普通登革热高频中药公因子聚类结果Table 4 Clustering results of common factors of high frequency Chinesemedicinals for dengue

图3 普通登革热高频中药公因子聚类树状图Figure 3 Clustering dendrogram of common factors of high frequency Chinesemedicinals for dengue

3.4 网络药理学结果基于上述分析所挖掘的证型及方药结果，认为登革1号方、2号方可运用于普通登革热之“风热夹湿，邪在卫气”证，而登革3号方适用于普通登革热之“湿热伤络，邪侵营血”证。故本研究通过网络药理学的方法，对比了3首新方治疗普通登革热不同证型的潜在机制。

3.4.1中药的活性成分及靶点 共搜集到登革1号方的活性成分107个，其中有95个活性成分能获取到药物靶点，共869个。登革2号方共搜集到185个活性成分，其中175个活性成分可获取到药物靶点，共1 024个。登革3号方可获取活性成分135个，其中125个活性成分可获取药物靶点，共960个。

3.4.2症状相关靶点和交集靶点 “风热夹湿，邪在卫气”证共检索到2 312个相关靶点。“湿热伤络，邪侵营血”证共获得408个靶点。

登革1号方、登革2号方和“风热夹湿，邪在卫气”证各有交集靶点357个、381个，详见图4-A、图4-B。登革3号方和“湿热伤络，邪侵营血”证的交集靶点为72个，如图4-C所示。

图4 中药治疗普通登革热的韦恩图Figure 4 Venn diagram of Chinesemedicinals for dengue

3.4.3关键成分、靶点对比对 交集靶点进行PPI网络分析，见图5。PPI网络的圆点面积与degree值成正比。利用交集靶点绘制“药方-活性成分-靶点-证型”网络，如图6所示。对网络分析所得的关键成分以及靶点进行对比，详见表5、表6。

表5 中医治疗普通登革热新方活性成分对比Table 5 Comparison of active components in new Chinese medicinals formulas for dengue

表6 中医治疗普通登革热新方主要靶点对比Table 6 Comparison ofmain targets of new Chinese medicinals formulas fordengue

注：A.登革1号方治疗“风热夹湿，邪在卫气”证；B.登革2号方治疗“风热夹湿，邪在卫气”证；C.登革3号方治疗“湿热伤络，邪侵营血”证图5 中药治疗普通登革热的PPI网络Figure 5 PPI network of Chinese medicinals for dengue

3.4.4GO富集分析对比 GO富集分析的对比结果见图7～图9。由图可知，登革1号方所富集的GO生物过程与登革2号方所富集的大同小异，但登革3号方却有明显差异。这与登革1号方、登革2号方均治疗“风热夹湿，邪在卫气”证，而登革3号方治疗“湿热伤络，邪侵营血”证的情况相对应。

注：F1.登革1号方；F2.登革2号方；F3.登革3号方图7 中医治疗普通登革热新方GO-BP分析结果比较Figure 7 Result comparison of GO-BP analysis of new Chinese medicinals formulas for dengue

BP分析见图7，3首新方治疗普通登革热均富集了蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性的正调节。此外登革1号方富集了MAP激酶活性的正调节、对营养水平的反应等。登革2号方富集了细胞钙离子稳态、肽基酪氨酸磷酸化等。登革3号方富集了白细胞凋亡过程、T细胞活化、炎症反应调节等。

CC分析见图8，膜微区、薄膜筏、膜区等是3首新方所共同富集的条目。

MF分析见图9，均富集了蛋白磷酸酶结合、蛋白酪氨酸激酶活性。登革1号方和登革2号方所富集的MF条目大致相同，例如G蛋白偶联肽受体活性等。登革3号方主要富集了生长因子受体结合、细胞因子受体结合、细胞因子活性等。

3.4.5KEGG富集分析对比KEGG通路富集分析对比结果提示，登革1号方和登革2号方所涉及的通路大部分相似，而登革3号方所涉及的通路却有所不同。此外，在这些共同富集的通路中，其显著性也存在差异，见图10。

注：F1.登革1号方；F2.登革2号方；F3.登革3号方图10 中医治疗普通登革热新方KEGG分析结果比较Figure 10 Result comparison of KEGG analysis of new Chinese medicinals formulas for dengue

由图10可知，EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等为3首新方共同富集的通路。但富集程度不同，例如糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路在登革1号方、登革2号方中显著性较高，而在登革3号方中显著性较低。

登革1号方主要富集了TNF信号通路、HIF-1信号通路等。登革2号方主要富集了MAPK信号通路、钙信号通路、HIF-1信号通路等。登革3号方主要富集了JAK-STAT信号通路、TNF信号通路、Toll样受体信号通路、C型凝集素受体信号通路、PI3K-Akt信号通路等。

4 讨论

4.1 普通登革热中医证型从中医证型推测病因病机，普通登革热发病诱因虽是蚊虫叮咬致使疫毒从肌表而入，但疾病的本质是湿热。而湿热的缘由，外有环境因素，内有体质因素。朱丹溪言：“东南地土卑弱，湿热相火为病甚多”。广东位属亚热带季风气候区，气候炎热，且湿润多雨，常雨热同期，易成湿热病邪侵袭人体；而广东人素有饮凉茶习惯，也喜海鲜、老火汤等滋腻之品，久则易伤脾阳，脾失运化，致痰湿内生，日久化热化火，而成湿热体质。故疫毒同湿热搏结，发为登革热。

从中医证型与疾病进展的关系而言，“风热夹湿，邪在卫气”证处于疾病初始期，风、热、湿三邪致病，邪在卫气，以卫为主。“湿热伤络，邪侵营血”证处于疾病中期，病邪由表入里，湿热之邪炽盛，有扰动营血的趋势，却未达到营血分热盛迫血妄行的地步。相应地，“湿热伤络，邪侵营血”证的患者属于普通登革热，出现的红色皮疹、出血均为轻微程度，未有大量出血的症状，也无神昏、谵语等危重症状。而“肺脾气虚，余邪未尽”证处于疾病后期，因湿性黏滞，病程缠绵，余邪难清，久久不愈；又因发病时邪盛伤正，攻于上中二焦为主，故病后肺脾气虚。

从中医证型的频次上分析，本研究对象为普通登革热，多数症状为恶寒、发热、头痛、肌肉酸痛，少数兼有皮疹、轻微出血。故以“风热夹湿，邪在卫气”频数居首位，“湿热伤络，邪侵营血”次之。又因本次研究针对的患者为住院患者，一般超过48 h无发热、病情稳定则可出院，故“肺脾气虚，余邪未尽”频数最少。

从中医证型与西医疾病分期的关系来讲，“风热夹湿，邪在卫气”证、“湿热伤络，邪侵营血”证属于发热期，而“肺脾气虚，余邪未尽”证属于恢复期。这也符合指南[1]中所提及的：多数登革热患者属于普通登革热，可仅有发热期与恢复期。

4.2 普通登革热中药新方登革1号方以银翘散为底，增加一些祛除上、中二焦湿邪的药物，则可疏风清热、兼以祛湿，适用于“风热夹湿，邪在卫气”证之风热盛者。登革2号方由岗藿抗感汤化裁而成，岗藿抗感汤是广东省名中医刘小虹教授治疗病毒类疾病的经验方，原方组成为岗梅根、广藿香、连翘、金银花、羌活、防风、荆芥穗、苍术、柴胡、人工牛黄[18]。登革2号方可清热解毒、疏风祛湿，适用于“风热夹湿，邪在卫气”证之热毒重者。登革3号方源于甘露消毒丹，结合三仁汤之“三仁”以宣上、畅中、利下，祛三焦湿邪，再加白茅根、紫草凉血止血，全方功擅清热祛湿、凉血止血，适于“湿热伤络，邪侵营血”证。

4.3 中药治疗普通登革热的可能机制

4.3.1活性成分 3首新方均可能包含了槲皮素、木犀草素等活性成分。槲皮素具备较佳的抗登革病毒（DENV）-2活性，可能与抑制RNA聚合酶、抑制病毒复制相关[19]。木犀草素能够有效抑制四种血清型DENV复制，可能通过非竞争性方式抑制弗林蛋白酶活性，抑制病毒粒子成熟，进而减少感染性病毒颗粒的形成而发挥作用[20]。

登革1号方和登革2号方可能含有黄芩素、柚皮素等活性成分。研究发现黄芩素能在细胞外直接杀伤DENV-3，且阻断DENV-3附着于Vero细胞上[21]。柚皮素能抑制Huh7.5细胞中四种血清型DENV的复制[22]。

对于每条新方特有的成分，登革1号方的异鼠李素也被证实了可通过RIG-I/JNK途径显著缓解流感病毒引发的过度炎症反应[23]。登革2号方的千层纸素A处理DENV感染的细胞后，病毒会出现生成缺陷，且细胞内出现DENV E蛋白的积累，这表明千层纸素A可能影响了病毒复制阶段的装配/外出[24]。登革3号方的艾黄素是一种抗凋亡剂、抗氧化剂，可激活ERK1/2与Akt发挥内皮保护功能[25]。

4.3.2作用靶点 TNF、IL6、AKT1和IL1B等可能是3首新方发挥登革热治疗作用的靶点。临床研究[26-27]发现，登革热患者血清的IL6、TNF-α、IL1B等细胞因子水平高于健康人。DENV感染后，TNF-α产生异常与血小板活化、单核细胞减少、血小板减少高度相关，中和TNF-α后，上述情况可发生逆转[28]。TNF-α还可促进DENV引起的神经毒性和血管内功能障碍，抗TNF-α可抑制DENV引发的脑炎等神经病变[29]。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，包括Akt1，Akt2和Akt3[30]。PI3K-Akt信号传导的病毒调节是病毒急性感染、长期存活与转化过程中抑制凋亡的关键机制[31]。

登革1号方还可能调节VEGFA发挥治疗普通登革热的作用。研究表明急性DENV-2感染会引起促炎细胞因子、趋化因子与生长因子升高，例如VEGFA[32]。登革2号方治疗普通登革热可能与NOS2有关。作为固有免疫系统的效应器，NOS2衍生的NO能够诱发宿主对病原体的快速反应，且DENV感染的抗体依赖的增强作用可抑制NOS2表达，帮助DENV逃逸[33]。登革3号方可能通过MMP9发挥作用，DENV2可调节NS1以激活NF-κB信号通路，促进人外周血单核细胞与巨噬细胞中MMP9的表达与分泌；NS1还与MMP9相互作用，导致重要黏附蛋白与紧密连接蛋白的降解，破坏黏附与紧密连接，进而使内皮通透性升高，增加血管渗漏[34]。

4.3.3GO分析 3首新方治疗普通登革热可能共同涉及了蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性的正调节。DENV丝氨酸蛋白酶在病毒复制中起着关键作用，被视为DENV感染的关键药物靶标[35]。而本次挖掘的关键靶点Akt正是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，与其相关的PI3K-Akt通路也与病毒感染中的细胞凋亡密切相关[31]。登革1号方可能通过MAP激酶活性的正调节发挥普通登革热治疗作用，该酶参与了DENV感染引起的细胞应激和炎症反应[36]。登革2号方治疗普通登革热可能与调节细胞钙离子稳态有关。研究提出DENV感染可改变细胞钙离子稳态以促进病毒复制[37]。登革3号方治疗普通登革热的过程中可能涉及了T细胞活化、炎症反应的调节、白细胞凋亡过程，这些均与DENV感染引起的宿主细胞免疫应答密切相关。

4.3.4KEGG分析 3首新方治疗普通登革热可能共同涉及了糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等条目。AGEs结合RAGEs，表达促炎因子、活性氮中间体与活性氧，调节机体免疫应答，诱导炎症与免疫抑制[38]。由此可见，3首新方可能均与炎症、免疫等相关。

登革1号方、登革2号方可能涉及了HIF-1信号通路。HIF-1信号通路又称缺氧诱导因子1信号通路，缺氧可选择性增强DENV的RNA复制，这取决于HIF-1α/2α与AKT的激活[39]。此外，登革1号方还可能涉及了TNF信号通路；登革2号方还可能涉及了钙信号通路、MAPK信号通路。DENV中，磷酸化的p38 MAPK与细胞凋亡相关，抑制p38 MAPK与CD137途径可减少DENV诱导的TNF-α分泌和HepG2细胞凋亡[40]。

登革3号方可能涉及了Toll样受体、C型凝集素受体、PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、JAKSTAT信号通路等。其中多数通路和DENV感染的宿主免疫反应有关。C型凝集素受体、Toll样受体属于模式识别受体，能够识别DENV，诱导干扰素以及TNF-α等炎性细胞因子、趋化因子；其中I型干扰素又能够作用于JAK-STAT信号通路，影响干扰素刺激基因，进而影响病毒复制[41-42]。因此，登革3号方极有可能多环节地干预了宿主先天免疫应答，从而起到抗DENV的作用。而对于PI3K-Akt信号通路，DENV亚基因组RNA能够通过Bcl-2相关机制以影响PI3K/Akt信号通路，导致细胞凋亡[43]。此外，PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活与巨核细胞的生长与成熟密切相关，而DENV可影响PI3K/Akt/mTOR信号通路以及巨核生成的相关分子，例如GATA-1、GATA-2与NF-E2，进而诱发巨核细胞凋亡[44]。而血小板是由巨核细胞产生的，因此认为PI3K/Akt/mTOR信号通路可能与DENV感染期间的血小板减少有联系。故登革3号方有可能影响PI3K-Akt信号通路，抑制细胞凋亡，减少血小板下降。这也与“湿热伤络，邪侵营血”证中的红色皮疹、出血等症状符合。

4.3.5小结 综上所述，3首新方均可能具有抗DENV的作用，且可能与炎症、免疫、凋亡等密切相关。但登革1号方治疗“风热夹湿，邪在卫气”证可能更侧重于通过调节炎症起效；登革2号方治疗“风热夹湿，邪在卫气”证可能与病毒复制、病毒逃逸等相关；登革3号方治疗“湿热伤络，邪侵营血”证可能更侧重于免疫、凋亡方面，还可能与血小板生成、内皮功能有关。

4.4 本研究的局限性本研究回顾分析了普通登革热的临床病例，总结出中医辨证论治普通登革热的规律，又通过网络药理学方法探索了3首新方在分子机制层面的异同点。但本研究存在以下局限性：①本研究所挖掘的中药新方由计算机分析所得，3首新方所体现的治法治则虽与临床相符，但所含的药物数目较多，可为临床提供药物遴选参考，但在处方用药时，医生应根据患者实际情况对药物进行加减调整，方使疗效更佳。②由于纳入对象为住院患者，“肺脾气虚，余邪未尽”证的患者数目较少，且中药新方挖掘针对的是高频中药，故导致中药新方挖掘中没有发现与“肺脾气虚，余邪未尽”证相对应的中药复方。但是“肺脾气虚，余邪未尽”证归属于登革热的恢复期，症状相对较少，也可从个人饮食、起居等方面的调理养护来促进身体恢复。③网络药理学所提出的分子机制仅是计算机预测所得，后续仍需开展实验加以验证。