基于数据挖掘、网络药理学、分子模拟和实验验证探究治疗糖尿病足溃疡外用中药复方专利的用药规律及作用机制

周振华，周莉，张彬，李坤平，李博（广东药科大学中医药研究所，广东 广州 510006）

糖尿病作为最常见的慢性代谢性疾病之一，已成为全球重大公共卫生问题。据统计，截至2021年全球约有5.366亿人患有糖尿病，预计到2045年，这一数字将上升至7.832亿[1-2]。其中，糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcers，DFU）作为最常见、最严重的糖尿病并发症之一，可引发溃疡形成，并在患病后期存在截肢风险，给患者生活带来严重影响，甚至威胁着患者生命，给患者家庭及社会带来沉重的医疗经济负担[3-4]。元·罗天益《卫生宝鉴》也有“消渴病人足膝发恶疮，至死不救”的说法，揭示了糖尿病足溃疡乃中医消渴病症状的一部分，具有治疗周期长、易复发、病情复杂的特点[5]。

现阶段，西医主要通过控制血糖水平和采用降低局部压力和抗感染等手段来治疗DFU[6-7]。但各种原因导致的耐药菌增加，清创不彻底，使得西医临床治疗效果受到限制，而干细胞移植和外源性生长因子治疗等新技术虽然在小规模临床试验中显示出一定疗效，但由于高昂的成本以及设备和技术普及率较低，临床推广应用尚存在一定难度[8-9]。相对于西医治疗方法，中医主要运用辨证与内外治疗相结合等方式治疗DFU，这种综合治疗能够更好地理解糖尿病足的发病原因和机制，并在创面痊愈率和症状改善等方面取得更好的疗效[10-12]。

中医认为，糖尿病足溃疡的主要病机为气阴亏虚、瘀毒阻络，气虚运血无力，阴亏燥热煎熬津血，导致热毒内结、皮肤失养，伤口难以愈合[13-14]。在《外科真诠》中有着“脱疽之生，止四余之末，气血不能周到”的记述，阐述了外治法在治疗脱疽时弥补了内治法不能濡养四肢末端的不足[15]；《理瀹骈文》指出；“外治之理，即内治之理，外治之法即内治之法，所异者法耳”，强调了外治法在治疗外科疾病中的重要性[16]。外用中药复方专利来源于临床长期实践，多有效验且可重复性强，其在中医外治法治疗外科疾病中扮演着重要的角色。

为了挖掘DFU外用中药复方专利用药规律并探究其分子机制，本研究通过检索中国国家知识产权局中治疗DFU的相关外用中药复方专利，利用数据挖掘方法总结外用中药复方专利的用药规律[17]；运用网络药理学方法发现其核心中药、主要活性成分及所对应治疗DFU的靶点，预测治疗DFU的重要信号通路，对核心靶点和主要活性成分进行分子对接分析以及动力学模拟，并进一步通过实验证实关键活性成分豆甾醇主要通过调控PI3K及Akt信号通路发挥促进DFU创面愈合的作用，为筛选确认用于DFU治疗的新型外用中药组合奠定基础。

1 资料与方法

1.1 专利数据挖掘研究

1.1.1数据来源 中国国家知识产权局（https：//www.cnipa.gov.cn/）专利检索与分析系统，以“糖尿病足，中药，外用”“糖尿病溃疡，中药，外用”“糖尿病足，中药”为关键词进行检索，检索区间为建库至2023年4月，结果合并去重得到DFU外用复方中药数据集。

1.1.2纳入与排除标准 纳入标准：纳入所有外用治疗糖尿病足的中草药复方专利（包括使用熏洗法、湿敷法、足浴法等中药外治法的专利）；纳入所有以中药或中西医结合外用防治糖尿病足的专利。排除标准：排除非外用治疗糖尿病足的中药复方专利、中草药相关提取物的专利；排除所有未给定详细复方组成成分的中草药专利；排除有关外用调制糖尿病足护理装置的专利。

1.1.3数据处理 参照2020年版《中华人民共和国药典》及《中华本草》对中药的名称进行标准化处理，并以《中药学》进行补充，如“白芨”规范为“白及”。若为中药提取物、中药粉末、中药炮制品等则转换为对应的中药。

1.1.4数据录入及核对 将处理过的数据录入到中医传承计算平台，并对数据进行校对审核，确保数据准确无误，防止出现重复或遗漏现象。

1.1.5数据分析 基于中医传承计算平台“数据分析”中的“统计分析”模块对上述数据集进行数据挖掘，对录入数据中的药物频数、四气五味、归经功效进行数据统计；利用“关联规则”模块进行药物之间的关联规则分析，将支持度及置信度分别设置为12和0.6，得到关联规则；基于“聚类分析”模块，将聚类个数设置为4，对录入数据的中药进行聚类分析。

1.2 网络药理学分析

1.2.1核心中药活性成分的筛选 将上述数据集中频数排前3位的中药录入中药系统药理学数据库与分析平台（traditional chinese medicine database and analysis platform，TCMSP）和草药-中医证候-西医症状-成分-靶标-疾病关联网络数据库（Symptom Mapping，SymMap）检索其活性成分，筛选标准如下：口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和药物相似性（drug-like properties，DL）≥0.18，合并去重后建立核心中药活性成分数据集。

1.2.2活性成分作用靶点筛选及 “核心中药-活性成分-相关靶点”网络图的构建将上述核心中药活性成分数据集输入SwissTarget数据库，选择物种为“Homo sapiens”，条件设为“Probability＞0”，检索去重后得到活性成分作用靶点。将收集的“核心中药”“核心中药活性成分”及“核心中药活性成分作用靶点”导入Cytoscape软件，构建“核心中药-活性成分-相关靶点”网络图。

1.2.3核心中药-DFU共有靶点的获取及“疾病-核心中药-活性成分-共有靶点”复杂网络图的构建 在DisGeNET数据库、Genecards数据库、疗效药靶数据库（therapeutic target database，TTD）、人类在线孟德尔遗传数据库（online mendelian inheritance in man，OMIM）和DrugBank数据库中分别以关键词“diabetic ulcer”“diabetic foot”和“diabetic foot ulcer”进行检索，合并去重后建立DFU疾病靶点库。将核心中药活性成分作用靶点和DFU相关靶点取交集后得到共有靶点，即为核心中药治疗DFU的作用靶点。将“核心中药”“DFU”“核心中药活性成分”以及“共有靶点”导入Cytoscape软件，构建“疾病-核心中药-活性成分-共有靶点”网络图。

1.2.4PPI网络图的构建 把共有靶点导入STRING数据库（search tool for recurring instances of neighbouring genes，STRING），选择物种仅限于“Homo sapiens”，置信度得分设置为≥0.4，使用Cytoscape软件构建潜在关键靶点网络，生成PPI网络图（protein-protein interaction networks，PPI）。

1.2.5生物通路富集分析 通过GO（gene ontology，GO）功能和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析共有靶点基因，运用DAVID数据库分析GO功能和KEGG通路富集结果。其中，GO富集分析包含生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组成（cell component，CC）3个部分。

1.3 结合模式分析从PubChem网站下载小分子文件；在RCSB PDB数据库中下载TNF-α（PBD ID：6OP0）、PPARγ（PDB ID：5YCP）包含阳性化合物且构象分辨率最小、属于“Homo sapiens”的晶体结构文件。利用Discovery Studio软件分子对接模块对复合物的原配体阳性化合物进行redock，以验证对接软件的准确性；之后对处理后的小分子和蛋白执行对接命令。最后，使用Pymol软件绘制对接后复合物构象的分子对接可视化图。将对接好的复合物的“pdb”格式文件，在Gromacs软件中分别进行能量最小化、NVT和NPT平衡，最后开始总时长为20 ns的分子动力学模拟。

1.4 细胞实验

1.4.1细胞与试剂 人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVEC），购自中国科学院上海细胞库。豆甾醇（货号：S111185），购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DMEM培养基（货号：C11995500BT），购自英潍捷基（上海）贸易有限公司；10%胎牛血清（货号：10270-106）、二甲基亚砜（货号：ST038），购自特科思（广州）科技服务有限公司；Cell Counting Kit-8（货号：B34302），购自美国Selleck公司。

1.4.2仪器 Eon多功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；LightCycler480荧光定量PCR仪，美国Roche公司。

1.4.3CCK-8法检测豆甾醇对HUVEC细胞的影响 在96细胞培养板中按1×104个/孔接种HUVEC细胞。在培养24 h后分别按下列浓度加入豆甾醇（1.562、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200μmol·L-1）干预24 h，之后每孔加入10μL的CCK-8溶液，孵育2 h。在多功能酶标仪450 nm波长下检测吸光度值。

1.4.4qPCR法测定PI3K和Akt1的mRNA表达水平 加入不同浓度的豆甾醇处理HUVEC细胞24 h后提取总RNA。引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.5统计学处理方法使用GraphPad Prism软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 数据挖掘研究结果

2.1.1中药频数分析 经专利数据库检索共获得相关专利510项，经纳入标准筛选后得到专利98项，均为中草药复方专利，其中包含中药281味，总频数共计968次，复方中药物数量最少4味，最多31味。其中频数≥18次的有16味，结果见表2。

表2 中药复方专利治疗糖尿病足溃疡药物频数分布（频数≥18次）Table 2 Frequency distribution ofmedicinalmaterial in patents for Chinesemedicine compound formulasagainstDFU（frequency≥18）

2.1.2四气、五味、归经和功效分析 所涉及中药281味中，寒性、苦味、归肝经中药应用次数最多，具体分布结果见表3、表4、图1。

图1 四气、五味、归经频数分布雷达图（频数/次）Figure 1 Radar map for frequency distribution of four natures，five flavors and meridian tropism（frequency≥time）

表3 中药复方专利治疗糖尿病足溃疡性味频数分布Table 3 Frequency analysis of four natures and five flavors of patents for Chinesemedicine compound formulas against DFU

表4 中药复方专利治疗糖尿病足溃疡归经频数分布Table 4 Frequency analysis of meridian tropism of patents for Chinese compound formulas against DFU

2.1.3用药关联规则分析 设置支持度≥12和置信度≥0.6，得到10对具关联规则的药物组合，具体见表5。基于以上参数设置绘制网络拓扑图可以直观地展示药物关联规则，结果见图2。

图2 中药复方专利治疗糖尿病足溃疡用药关联规则可视化分析（支持度≥12，置信度≥0.6）Figure 2 Visual analysis of association rules of medicinal material of patents for Chinese compound formulas against DFU（support threshold≥12，confidence coefficient≥0.6）

表5 中药复方专利治疗糖尿病足溃疡用药关联规则分析（支持度≥12，置信度≥0.6）Table 5 Association rule analysis ofmedicinalmaterial of patents for Chinese compound formulas against DFU（support threshold≥12，confidence coefficient≥0.6）

2.1.4聚类分析 见表6。对录入的处方进行聚类分析，设置聚类数为4，得到4类核心组合，其中频数最高的核心组合为“黄柏-大黄-红花-当归-苦参-乳香”，共出现33次。

表6 中药复方专利治疗糖尿病足溃疡药物聚类核心组合Table 6 Cluster analysis of core drug combinations

2.2 核心中药治疗DFU的机制研究

2.2.1核心中药的活性成分及其潜在作用靶点 根据数据挖掘结果选择出现频数最高的前三味中药当归、黄柏、红花作为核心中药。从TCMSP数据库和SymMap数据库中共获得当归、黄柏、红花三味核心中药的活性成分85个，在SwissTarget数据库中获得其对应靶点1 459个，筛选去重后获得889个靶点。

2.2.2“核心中药-活性成分-相关靶点” 可视化网络图见图3。根据“2.2.1”项下整理的数据，将其导入Cytoscape软件中构建可视化网络图，可对核心中药、活性成分及对应靶点的关系进行可视化分析。

注：圆形代表核心中药对应的活性成分（紫色表示当归成分；绿色表示黄柏成分；蓝色表示红花成分；红色表示共有成分）；菱形代表活性成分所对应的靶点图3 中药复方专利治疗糖尿病足溃疡“核心中药-活性成分-相关靶点”网络图Figure 3 Network diagram of“core Chinesemedicinals-active ingredients-targets”

2.2.3核心中药-DFU共有靶点Venn图和“疾病-核心中药-活性成分-共有靶点”网络图的构建 见图4。通过筛选去重后，得到DFU潜在靶点838个，将核心中药潜在靶点与DFU靶点取交集，共得到166个共有靶点。使用Cytoscape软件生成“疾病-核心中药-活性成分-共有靶点”网络图，分析3味核心中药主要成分与共有靶点的关系，该网络图共有253个节点和3 740条边，见图5。

注：DFU、DG、HB、HH分别表示糖尿病足溃疡、当归、黄柏、红花图4 中药复方专利治疗糖尿病足溃疡核心中药-糖尿病足溃疡（DFU）共有靶点韦恩（Venn）图Figure 4 Venn diagram of intersection targets of core Chinese medicinals in patents for Chinese compound formulas against DFU-DFU

注：圆形代表核心中药对应的活性成分（紫色表示当归成分；绿色表示黄柏成分；蓝色表示红花成分；红色表示共有成分）；V字形代表DFU，菱形代表活性成分和DFU的共有靶点；DFU表示糖尿病足溃疡图5 中药复方专利治疗糖尿病足溃疡“疾病-核心中药-活性成分-共有靶点”网络图Figure 5 Network diagram of“disease-core Chinesemedicinals-active ingredients-intersection targets”

2.2.4PPI网络的构建及可视化分析 见图6。将共有靶点输入STRING数据库构建PPI网络图中，选择度值前8位的靶点作为核心中药治疗糖尿病足的核心靶点，包括肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARγ）、血管内皮生长因子A（Vascular endothelial growth factor A，VEGFA）等。

注：A.全部共有靶点的PPI网络图。随着度值的升高，节点图形越来越大，颜色越来越深。B.根据Degree值≥61筛选所得靶点。C.根据Degree值≥90筛选所得靶点，确定为治疗糖尿病足溃疡（DFU）的核心靶点图6 中药复方专利治疗糖尿病足溃疡PPI网络图Figure 6 PPI network diagram in patents for Chinese compound formulasagainstDFU

2.2.5GO和KEGG通路富集结果与分析 通过DAVID数据库进行GO功能富集分析，设定参考值P＜0.05，以P值排前20位的条目作图，共筛选得出831个条目。其中生物过程（BP）条目625个（75%），分子功能（CC）条目69个（8%），细胞组成（MF）条目137个（17%），结果见图7。通过DAVID数据库进行KEGG通路分析，设定参考值P＜0.05，以P值排前20位的条目作图，共筛得出157个条目，结果见图8。

图7 中药复方专利治疗糖尿病足溃疡各组分占比圆饼图（A）及生物过程（BP）（B）、分子功能（MF）（C）、细胞组成（CC）（D）的GO分析Figure 7 GO analysis of each component proportion pie chart（A），biological process（BP）（B），molecular function（MF）（C），and cell composition（CC）（D）

图8 中药复方专利治疗糖尿病足溃疡KEGG通路富集分析Figure 8 KEGG pathway enrichment analysis of patents for Chinese compound formulas against DFU

2.3 结合模式分析结果靶点蛋白复合物中原配体在对接前后的构象变化幅度可用于评价分子对接及评价系统的可靠性。本研究抽取了靶标蛋白（TNF-α和PPARγ）中的配体小分子进行redock分析，其RMSD值均小于2，验证了所选择的对接程序具有较好的对接准确性。基于此，将上述蛋白分别与其对应的活性成分二氢尼洛替星（Dihydroniloticin）、豆甾醇（stigmasterol）进行分子对接，构建分子对接模式图。结果表示，TNF-α结合二氢尼洛替星打分值为120.631，TNF-α结合所对应的阳性化合物打分值为169.272；PPARγ结合豆甾醇打分值为109.409，PPARγ结合所对应的阳性化合物打分值为126.42。各化合物对接后的打分值均与所对应的化合物相当，且结合位点类似，相关靶点与活性成分具有良好结合活性，结果见图9。

注：A、D分别代表各复合物的原始构象（粉色）和阳性化合物重新对接后的构象（橙色）叠加，RMSD值均小于2；B、C代表TNF-α分别与其对应的阳性化合物和二氢尼洛替星对接后的最佳构象；E、F代表PPARγ分别与其对应的阳性化合物和豆甾醇对接后的最佳构象图9 中药复方专利治疗糖尿病足溃疡核心靶点与其阳性化合物和活性成分的分子对接Figure 9 Molecular docking of core targets with their positive compounds and active ingredients of patents for Chinese compound formulas against DFU

分子动力学模拟可用于评价复合物系统的稳定性。将上述对接产物进行分子动力学模拟，结果表明，复合物的RMSD值与阳性化合物类似，RMSD曲线在20 ns运行时间内均趋于平衡稳定，相关靶点与对应活性成分可形成稳定构象，结果见图10。

图10 中药复方专利治疗糖尿病足溃疡分子动力学模拟结果Figure 10 Molecular dynamics simulation results of patents for Chinese compound formulas against DFU

2.4 实验验证结果

2.4.1豆甾醇对HUVEC细胞的影响 为了进一步验证关键活性成分豆甾醇的作用机制，首先通过CCK-8法对豆甾醇的生物安全性进行评价。结果表明，豆甾醇在1.562～200μmol·L-1浓度范围内对HUVEC没有明显细胞毒性，结果见图11。

图11 豆甾醇对HUVEC细胞增殖的影响（±s，n=5）Figure 11 Effects of different concentrations of stigmasterol on HUVEC proliferation（±s，n=5）

2.4.2豆甾醇对HUVEC细胞PI3K和Akt1转录水平的影响 本课题组前期的网络药理学结果表明，豆甾醇主要通过激活PI3K及Akt相关信号通路，达到治疗DFU的效果。基于此，本研究采用qPCR法检验了HUVEC在经过豆甾醇处理前后PI3K和Akt1的转录表达水平。如图12所示，结果证实12.5、25μmol·L-1豆甾醇可以明显上调PI3K和Akt1的mRNA水平（P＜0.001），表明其可激活PI3K及Akt相关信号通路。

注：A、B分别代表豆甾醇对Akt1和PI3K转录水平的影响。与对照组（0μmol·L-1）比较，***P＜0.001图12 豆甾醇对PI3K和Akt1的m RNA水平的影响（±s，n=3）Figure 12 Effect of stigmasterol on PI3K and Akt1mRNA expression（±s，n=3）

3 讨论

中医学认为，糖尿病足溃疡的基本病理机制是本虚标实，即长期消渴导致气血阴阳运行不畅，形成瘀血内生阻络。这些改变进一步导致气虚、痰湿、湿热、寒湿等病理变化，使得津液和血液难以互渗，骨髓失养，最终发展为“脱疽”[18-19]。因此，针对DFU的病理本质，外治法所使用的中药复方应以补气通络、滋阴活血、清热解毒为主要治疗方向。本研究通过挖掘DFU外用中药复方专利用药规律并探究其分子机制，验证有关中医治疗DFU的理论。

在数据挖掘结果中，四气五味分别以寒性、苦味药物占比最大，分析可知，治疗DFU以能和能缓，能燥能坚的清热益气、泻火存阴功效药物为主。另外关联规则显示当归-黄柏、当归-红花、黄柏-红花，支持度较高，是治疗DFU较为常见的药物组合，其功效亦主要以清热解毒，益气养阴，活血祛瘀为主，均符合中医外治法的用药理念。其中，治疗DFU频数居前3位的中药分别是当归、黄柏、红花。当归，味甘、辛、苦，性温，可用于活血祛瘀，风湿痹痛，痈疽疮疡；黄柏，味苦，性寒，可用于清热、解毒、消渴；红花，味辛，性温，可用于活血通经，祛瘀止痛。三者相合共奏益气养阴，养血通络之效。三者均具有补气、活血等功效，与中医传统理论相符，证明中药复方专利选药的准确性。

为发掘核心中药治疗DFU的潜在作用机制，对核心中药进行网络药理学和分子对接分析及分子动力学模拟[20-21]。结合网络药理学结果，推测治疗DFU的核心靶点可能有TNF、Akt1、PPARγ等，并通过PI3K及Akt信号通路、MAPK信号通路等发挥抗炎、抗菌、促进血管生成作用，实现多通路协同治疗DFU[22-23]。

前期研究[24-27]发现，TNF-α抑制剂和PPARγ激动剂具有发挥抗炎、促进DFU伤口愈合的功能，故选择PPI网络所筛选的核心靶点中的TNF-α和PPARγ分别与对应的核心中药治疗DFU的主要有效成分二氢尼洛替星、豆甾醇进行分子对接和分子动力学模拟。其中，已有研究[28-29]表明豆甾醇具有多种功效，包括抗氧化、抗炎、抗糖尿病和降低胆固醇等作用，可明显改善血脂、血糖、肌酐和脂质过氧化反应水平等。此外，豆甾醇还能够通过下调核转录因子κB（NF-κB）信号通路，改善炎症反应[30-31]。而关于二氢尼洛替星，虽然目前尚未有文献明确报道其具有治疗DFU的作用，但根据本分子对接和分子动力学模拟结果，观察其可以与核心靶点稳定结合，且打分值、结合位点均与阳性小分子相似。综合结果分析，豆甾醇和二氢尼洛替星可能通过与核心靶点相结合，从而发挥抗炎和促进伤口愈合的功能，达到治疗DFU的目的。

基于以上预测结果，本研究进行分子生物学实验予以验证。实验结果显示，豆甾醇可以上调PI3K和Akt1的转录水平，激活PI3K及Akt信号通路，符合GO分析和KEGG信号通路分析结果，表明豆甾醇可通过上调该信号通路，进而促进细胞增殖和血管增生，促进DFU创面伤口愈合，可为后续研究该活性成分的医用价值提供新思路[32]。

综上所述，本研究通过数据挖掘从国家专利数据库治疗DFU的外用中药复方专利中筛选出了3个潜在的具有治疗DFU的核心中药，分别是当归、黄柏、红花。运用网络药理学研究发现以上核心中药在DFU治疗中主要涉及PI3K及Akt等信号通路，并确定核心中药所作用的核心靶点有TNF、Akt1、PPARγ等；通过对其核心作用靶点及其对应的中药活性成分进行分子对接分析和分子动力学模拟分析证实，核心靶点均能与相对应核心活性成分稳定结合。最后，实验研究证实了豆甾醇主要通过激活PI3K及Akt信号通路达到治疗DFU的目的。本研究基于多维数据分析及实验验证开展研究，为适用于DFU治疗的新型外用产品的开发奠定了基础。