血根碱对腰椎间盘突出症大鼠炎性疼痛的改善作用及机制Δ

阮祯 ，何生华 ，龚雪花 ，乔松 ，王超 （.武汉市中医医院推拿科，武汉 40000；.武汉市第七医院中南路街第一社区卫生服务中心，武汉 40060；.湖北省中西医结合医院康复医学中心推拿科，武汉 4000）

腰椎间盘突出症（lumbar disc herniation，LDH）是一种常见的临床脊柱疾病，是由于各种原因导致腰椎间盘纤维环部分或完全破裂，髓核组织从破裂口向后突出，刺激或压迫神经根和马尾神经的临床综合征[1]。LDH具有腰痛、麻木、下肢疲劳等多种临床表现，严重影响患者的生活质量和工作能力。研究表明，LDH的发病机制与机械性神经根压迫和炎症有关，LDH髓核病变导致背根神经节（dorsal root ganglia，DRG）炎症反应增强，会引起持续性疼痛反应[2]。目前，LDH的治疗方案主要是保守治疗和手术治疗，但是大多数保守治疗可能出现症状无改善的情况，而手术治疗存在一定副作用。因此，迫切需要治疗效果更好的新药来治疗LDH引起的神经性疼痛。

血根碱（sanguinarine，SG）是从血根草和其他罂粟蓝堇属植物的根中提取的生物碱，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化和抗肿瘤作用[3]。已有研究表明，SG可通过抑制小胶质细胞和丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信号通路的激活来减轻神经性疼痛[4]。因此，本课题组推测SG对LDH大鼠炎性疼痛有改善作用。研究表明，各种炎症刺激会导致免疫细胞中MAPK、胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）和c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinases，JNK）的磷酸化激活，激活的MAPK可促进核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的激活，进而促进肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）的产生。有报道指出，激活LDH大鼠脊髓组织中MAPK/ERK/NF-κB信号通路可促进炎症反应，进而导致神经性疼痛[5]。此外，有研究表明，SG可通过抑制慢性缩窄损伤大鼠脊髓组织中p38 MAPK激活的神经炎症来减轻神经性疼痛[6]。但SG是否可通过抑制MAPK/ERK/NF-κB信号通路激活，减轻LDH大鼠炎性疼痛尚不明确。基于此，本研究基于MAPK/ERK/NF-κB信号通路，探讨SG对LDH大鼠炎性疼痛的改善作用及机制，旨在为SG应用于LDH的治疗提供理论依据。

1 材料

1.1 动物

1.2 主要试剂与仪器

SG标准品（批号230604，纯度≥98%）购自武汉艾美捷科技有限公司；Anisomycin（MAPK激活剂，批号221115，纯度≥99%）购自美国MCE公司；苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒（批号221209）购自上海一研生物科技有限公司；TNF-α、神经肽Y（neuropeptide Y，NPY）的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（批号分别为230204、230412）均购自上海信裕生物科技有限公司；5羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、IL-1β的ELISA试剂盒（批号分别为220908、220814）均购自武汉菲恩生物科技有限公司；兔源离子钙接头蛋白1（ionized-calcium binding adaptor molecule-1，Iba-1）、胶质原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）、p38 MAPK、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、ERK1/2、磷酸化NF-κB p65（p-NFκB p65）、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β和GAPDH抗体（批号分别为221103、221216、230105、230403、230212、230310、230306、221109、221004、230304、230211）均购自英国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗（批号230106）购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 主要仪器

本研究所用主要仪器有Multiskan GO型全自动酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）、CX23型光学显微镜（日本Olympus公司）、DM IL LED型荧光显微镜（德国Leica公司）、Ugo Basile型足底热痛仪（上海玉研科学仪器有限公司）。

2 方法

2.1 动物分组、造模与给药

随机选取10只大鼠作为对照组，剩余大鼠参照文献[7]构建LDH模型，具体操作如下：麻醉大鼠，将背部和腹部脱毛，在距肛门约1 cm的尾根处切一个3～3.5 cm长的切口，从第二和第三椎骨之间的尾椎间盘中取出髓核。在背侧切开内侧纵切口，依次剥离皮肤、皮下组织和腰背筋膜，沿旋突左侧将骶棘肌剥离并分离，切断左侧L4至L5椎板、关节突和部分椎弓根，暴露左侧神经根以及L4、L5相应的DRG，将自体髓核放入硬膜外腔，缝合伤口。对照组大鼠暴露神经根，切除尾椎髓核，不进行移植。术后3 d静脉注射青霉素防止感染。当造模大鼠出现精神萎靡、行走缓慢、后肢跛行等行为时表明造模成功[8]。将造模成功的大鼠分为模型组和SG低、中、高剂量组以及SG高剂量+Anisomycin组，每组10只。SG低、中、高剂量组大鼠分别于腹腔注射1.00、2.50、6.25 mg/kg SG[3]，SG高剂量+Anisomycin组大鼠在腹腔注射6.25 mg/kg SG的同时腹腔注射Anisomycin 5 mg/kg[9]，对照组和模型组大鼠腹腔注射等体积生理盐水，每天1次，连续7 d。

2.2 大鼠一般情况及神经功能变化观察

末次给药结束后，观察各组大鼠一般情况，包括毛发、饮食、体重、运动情况等，并参考文献[10]对其神经功能进行评分：0级（2分），正常；1级（4分），步态基本正常，足趾异常；2级（6分），左后肢无力，轻度跛行；3级（8分），左后肢无力，跛行明显；4级（10分），站立不稳，左后肢活动；5级（12分），左后肢瘫痪，不能自主活动。

2.3 大鼠疼痛阈值检测

机械性痛觉过敏测定：“2.2”项下实验结束后通过Von Frey纤维丝测试大鼠右足机械痛阈。将大鼠固定于安静环境，施加足够的力将Von Frey纤维丝垂直刺激大鼠后爪表面6～8 s，若出现爪子迅速缩回、舔爪子或嚎叫即为阳性反应，将该力记为机械刺激缩足反射阈值（paw withdrawal mechanical threshold，PWMT）。每次测试间隔时间大约2 min，重复3次，取平均值。

热痛觉过敏测定：上述实验结束后采用热痛仪测试大鼠后爪足底的热敏感性，若大鼠出现缩足情况即为阳性反应，将开始刺激到出现阳性反应的时间记为热刺激缩足反射潜伏期（paw withdrawal thermal latency，PWTL）。热刺激时间为10～15 s，上限为20 s，以防止组织损伤。每次测试间隔5 min，重复3次，取平均值。

2.4 样本取材

痛觉实验结束后，麻醉处死大鼠，心脏取血，离心取上清，保存于－20 ℃用于TNF-α、IL-1β、5-HT、NPY检测。取血完成后，解剖大鼠，将椎旁肌与腰椎节段分离，切除椎间盘纤维环，暴露L4～L6节段髓核组织；收集DRG组织，一部分固定于4%多聚甲醛中，其余部分冷冻并保存在－80 °C。

2.5 大鼠DRG组织的病理学形态观察

将DRG组织于4 °C条件下固定于4%多聚甲醛中48 h，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗后经乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后，切成4 μm薄片；取部分切片（剩余部分用于免疫荧光实验）进行HE染色后，置于显微镜下观察DRG组织的病理变化。

“等等，把逃兵送师部，我到想听听他为什么要当逃兵，也想听听他是怎么躲过鬼子毒气弹的。”赵锡田做了个停止的动作。

2.6 大鼠血清中炎症因子和疼痛因子水平的检测

采用ELISA法进行检测。取－20 ℃保存的大鼠血清，按照ELISA试剂盒说明书，检测炎症因子TNF-α、IL-1β和疼痛因子5-HT、NPY的水平。

2.7 大鼠脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞活化情况的观察

采用免疫荧光法进行观察。取“2.5”项下剩余切片，以PBS洗涤后，透化30 min；以7%驴血清封闭1 h后，与一抗Iba-1（稀释度为1∶500）、GFAP（稀释度为1∶500）在4 °C孵育过夜；洗涤后与二抗（稀释度为1∶400）在室温下孵育45 min，以DAPI处理切片后，在荧光显微镜下观察切片并采集图像，采用Image Pro Plus软件分析Iba-1、GFAP蛋白（镜下均呈绿色荧光）的荧光强度。Iba-1蛋白荧光强度越高，表明脊髓小胶质细胞活化程度越高；GFAP蛋白荧光强度越高，表明星形胶质细胞活化程度越高。

2.8 大鼠DRG组织中MAPK/ERK/NF-κB信号通路相关蛋白和炎症相关蛋白表达检测

采用Western blot法进行检测。取各组大鼠DRG组织适量，经裂解液裂解后，取30 μg蛋白样品进行变性处理，然后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜；以5%脱脂牛奶封闭，在4 °C条件下加入p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-ERK1/2、ERK1/2、p-NF-κB p65、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β、GAPDH（稀释度均为1∶1 000）一抗孵育过夜；洗膜后，在室温下加入二抗（稀释度为1∶2 000）孵育60 min。采用凝胶成像仪显影，并使用ImagePro Plus软件分析蛋白条带灰度值，以p-p38 MAPK与p38 MAPK、p-ERK1/2与ERK1/2、p-NF-κB p65与NF-κB p65的灰度值比值表示p38 MAPK、ERK1/2、NF-κB p65蛋白的磷酸化水平，以TNF-α、IL-1β与内参蛋白（GAPDH）的灰度值比值表示两者的表达水平。

2.9 统计学方法

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析，数据采用±s表示。多组间比较用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，检验水准α＝0.05。

3 结果

3.1 SG对大鼠一般情况及神经功能的影响

对照组大鼠行为正常，毛发光滑，饮食与行为状态良好；模型组大鼠精神萎靡，毛发杂乱，食欲不振，体重下降，后肢运动障碍；SG各剂量组大鼠精神、食欲好转以及后肢运动障碍缓解，体重升高；SG高剂量+Anisomycin组大鼠的精神、运动状况较SG高剂量组下降。对照组、模型组、SG低剂量组、SG中剂量组、SG高剂量组、SG高剂量+Anisomycin组大鼠神经功能评分分别为（2.01±0.24）、（9.03±1.08）、（5.93±0.62）、（4.75±0.49）、（2.84±0.31）、（6.55±0.68）分。与对照组相比，模型组大鼠神经功能评分显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，SG各剂量组大鼠神经功能评分均显著降低（P＜0.05）；与SG高剂量组相比，SG高剂量+Anisomycin组大鼠神经功能评分显著升高（P＜0.05）。

3.2 SG对大鼠疼痛阈值的影响

与对照组相比，模型组大鼠PWMT、PWTL均显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，SG低、中、高剂量组PWMT、PWTL均显著升高（P＜0.05）；与SG高剂量组相比，SG高剂量+Anisomycin组PWMT、PWTL均显著降低（P＜0.05）。结果见表1。

表1 各组大鼠疼痛阈值比较（±s，n＝10）

表1 各组大鼠疼痛阈值比较（±s，n＝10）

a：与对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与SG高剂量组比较，P＜0.05。

PWTL/s 14.83±1.52 6.94±0.72a 8.25±0.88b 10.43±1.52b 12.47±1.35b 7.29±0.83c组别对照组模型组SG低剂量组SG中剂量组SG高剂量组SG高剂量+Anisomycin组PWMT/g 32.65±3.48 10.86±1.27a 18.04±2.15b 24.28±2.63b 29.07±3.15b 15.74±1.61c

3.3 SG对大鼠DRG组织病理变化的影响

对照组大鼠DRG椎间盘神经元细胞结构正常，细胞核完整。模型组大鼠DRG椎间盘神经元细胞排列紊乱，细胞肿胀，界限模糊，核仁染色不均。与模型组比较，SG各剂量组大鼠DRG椎间盘神经元细胞结构改善，细胞肿胀减轻，界限清晰，核仁染色均匀。与SG高剂量组比较，SG高剂量+Anisomycin组大鼠DRG椎间盘神经元细胞结构紊乱。结果见图1。

图1 各组大鼠DRG组织病理变化情况（HE染色）

3.4 SG对大鼠血清中炎症因子和疼痛因子水平的影响

与对照组相比，模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、NPY水平均显著升高，5-HT水平显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，SG各剂量组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、NPY水平均显著降低，5-HT水平均显著升高（P＜0.05）；与SG高剂量组相比，SG高剂量+Anisomycin组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、NPY水平均显著升高，5-HT水平显著降低（P＜0.05）。结果见表2。

表2 各组大鼠炎性因子和疼痛因子水平比较（±s，n＝10）

表2 各组大鼠炎性因子和疼痛因子水平比较（±s，n＝10）

a：与对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与SG高剂量组比较，P＜0.05。

NPY/（ng/L）108.36±11.42 186.25±19.38a 168.33±17.46b 142.29±15.71b 119.08±12.84b 171.46±18.63c组别对照组模型组SG低剂量组SG中剂量组SG高剂量组SG高剂量+Anisomycin组TNF-α/（pg/mL）57.23±6.07 182.47±19.36a 131.57±13.27b 98.64±10.57b 69.48±7.39b 142.38±15.83c IL-1β/（pg/mL）32.54±3.48 91.05±9.32a 72.88±7.46b 54.27±5.58b 39.41±4.06b 85.73±8.72c 5-HT/（ng/L）7.09±0.84 4.29±0.46a 4.98±0.52b 5.73±0.59b 6.59±0.57b 4.71±0.48c

3.5 SG对大鼠脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞活化的影响

与对照组相比，模型组大鼠脊髓小胶质细胞中Iba-1、星形胶质细胞中GFAP的阳性表达均显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，SG各剂量组大鼠Iba-1、GFAP的阳性表达均显著降低（P＜0.05）；与SG高剂量组相比，SG高剂量+Anisomycin组大鼠Iba-1、GFAP的阳性表达均显著升高（P＜0.05）。结果见图2（SG低剂量组图略）、表3。

图2 各组大鼠Iba-1、GFAP蛋白荧光染色结果

表3 各组大鼠DRG组织中Iba-1、GFAP蛋白荧光强度比较（±s，n＝10）

表3 各组大鼠DRG组织中Iba-1、GFAP蛋白荧光强度比较（±s，n＝10）

a：与对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与SG高剂量组比较，P＜0.05。

GFAP荧光强度1.08±0.12 4.37±0.46a 3.37±0.39b 2.43±0.29b 1.56±0.21b 3.85±0.39c组别对照组模型组SG低剂量组SG中剂量组SG高剂量组SG高剂量+Anisomycin组Iba-1荧光强度1.00±0.10 3.72±0.38a 2.97±0.32b 2.25±0.27b 1.58±0.17b 3.08±0.32c

3.6 SG对大鼠DRG组织中MAPK/ERK/NF-κB信号通路相关蛋白及炎症相关蛋白表达的影响

与对照组相比，模型组大鼠DRG组织中p38 MAPK、ERK1/2、NF-κB p65蛋白磷酸化水平和TNF-α、IL-1β蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，SG各剂量组大鼠DRG组织中上述指标水平均显著降低（P＜0.05）；与SG高剂量组相比，SG高剂量+Anisomycin组大鼠DRG组织中上述指标水平均显著升高（P＜0.05）。结果见图3、表4。

图3 各组大鼠DRG组织中相关蛋白表达的电泳图

表4 各组大鼠DRG组织中相关蛋白表达比较（±s，n＝10）

表4 各组大鼠DRG组织中相关蛋白表达比较（±s，n＝10）

a：与对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与SG高剂量组比较，P＜0.05。

p-p38 MAPK/p38 MAPK 0.42±0.05 0.93±0.10a 0.78±0.08b 0.60±0.07b 0.49±0.05b 0.81±0.09c p-ERK1/2/ERK1/2 0.31±0.03 0.96±0.10a 0.71±0.07b 0.58±0.06b 0.42±0.05b 0.81±0.09c p-NF-κB p65/NF-κB p65 0.22±0.03 0.89±0.09a 0.69±0.07b 0.48±0.06b 0.31±0.04b 0.72±0.08c IL-1β 0.58±0.06 0.92±0.11a 0.80±0.08b 0.75±0.09b 0.61±0.09b 0.88±0.11c组别对照组模型组SG低剂量组SG中剂量组SG高剂量组SG高剂量+Anisomycin组TNF-α 0.38±0.06 1.07±0.10a 0.72±0.08b 0.64±0.05b 0.44±0.08b 0.82±0.10c

4 讨论

LDH是一种常见的慢性疾病，是引起下腰痛和神经痛的主要原因。学者普遍认为机械压迫神经根是慢性疼痛的主要原因，但近期有研究表明，髓核引起的促炎因子释放是引起神经疼痛的重要病理机制[11]。LDH的治疗选择包括保守治疗和手术，但仅有10%～20%的患者适合手术治疗，因此，非手术治疗仍是大多数LDH患者的最佳选择[12]。目前，临床治疗LDH的药物易引起不良反应，且效果不佳，因此寻找新的治疗方法对改善LDH的炎性疼痛至关重要。

DRG作为感觉传入的初级神经元，在疼痛的产生和传递中起重要作用。本研究通过自体髓核抑制构建LDH大鼠模型，发现模型大鼠出现后肢运动障碍、椎间盘变性以及DRG组织中神经元细胞损伤，PWMT、PWTL显著降低，表明LDH模型构建成功，大鼠疼痛阈值降低，出现痛觉反应。小胶质细胞作为中枢神经系统的常驻巨噬细胞，在免疫反应中起着重要作用，活化的小胶质细胞可释放TNF-α、IL-1β，从而加重疼痛[13]。小胶质细胞和星形胶质细胞分别在疼痛发展的早期和中期被激活，Iba-1、GFAP分别为小胶质细胞和星形胶质细胞的特异性细胞标志物[14]。5-HT、NPY为疼痛因子，其中5-HT存在于神经系统，具有镇痛作用；抑制血清中NPY的表达，可减轻LDH患者的疼痛反应[15]。本研究发现，模型大鼠血清中TNF-α、IL-1β、NPY水平和Iba-1、GFAP阳性表达均升高，5-HT水平降低，表明模型大鼠出现炎性疼痛反应。经SG干预后，大鼠一般情况及神经功能改善，血清中TNF-α、IL-1β、NPY水平和Iba-1、GFAP阳性表达均降低，PWMT、PWTL、5-HT水平均升高，表明SG可能通过抑制DRG组织中小胶质细胞活化，减少炎症因子释放，提高大鼠疼痛阈值，进而减轻LDH大鼠炎性疼痛。

神经损伤引起的异常疼痛取决于MAPK信号通路的激活，在小胶质细胞活化的早期阶段，MAPK在促炎因子下启动，激活其信号分子p38 MAPK、ERK等，其中ERK主要分布在星形胶质细胞和神经元中，p38 MAPK主要分布在小胶质细胞中[16]。NF-κB是MAPK的另一个下游转录因子，其发生磷酸化后，导致核转位增加，进一步促进TNF-α、IL-1β等炎症因子的释放[17]。因此，抑制小胶质细胞的活化和MAPK/ERK/NF-κB信号通路的激活可以缓解周围神经损伤引起的痛觉过敏。本研究结果显示，经SG干预后，大鼠DRG组织中p38 MAPK、ERK1/2、NF-κB p65蛋白磷酸化水平和TNF-α、IL-1β蛋白表达水平均降低，表明SG可能具有抑制MAPK/ERK/NF-κB信号通路的作用。为了进一步验证SG是否通过抑制MAPK/ERK/NF-κB信号通路发挥作用，本研究在SG干预的基础上同时加入MAPK激活剂Anisomycin，结果发现，SG对模型大鼠的改善作用受到抑制，提示SG可能通过抑制MAPK/ERK/NF-κB信号通路，改善模型大鼠炎性疼痛。

综上所述，SG可通过抑制LDH大鼠DRG组织中小胶质细胞活化，减少炎症因子释放，提高疼痛阈值，从而改善炎性疼痛，其作用机制可能与抑制MAPK/ERK/NFκB信号通路有关。