马里苷对酒精性脂肪肝的保护作用及机制Δ

牛广豪 ，徐俊驰 ，顾利青 ，许英 ，顾宇人 ，宋华峰 #[.苏州市第五人民医院（苏州大学附属传染病医院）临床试验机构办公室，江苏 苏州 5000；.苏州市第五人民医院（苏州大学附属传染病医院）检验中心，江苏苏州 5000]

长期大量饮酒会引起酒精性脂肪肝（alcoholic fatty liver，AFL）[1]。AFL的发病机制非常复杂，由多种因素共同参与。其中，氧化应激和脂代谢异常在AFL的发生发展过程中具有重要作用[2]。过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα）是抑制肝脏脂质生成的关键蛋白，上调PPARα表达可以改善肝脏的脂代谢异常，减轻脂肪堆积[3]。研究表明，AFL的发生可能与PPARα调控的脂代谢通路抑制密切相关[4]。

马里苷的化学名为奥卡宁-4′-O-葡萄糖苷，是一种查尔酮类化合物，在两色金鸡菊头状花序的水和乙醇提取部位中含量最高[5]。近年来国内外研究发现，马里苷具有较多有益的药理活性，如改善糖脂代谢[6]、抗炎和抗氧化应激[7]等。同时有研究表明，马里苷可减缓糖尿病所造成的肝脏损伤[8]。本课题组前期研究已经证实，在缺氧诱导的心肌肥大细胞中，马里苷可以通过上调PPARα的表达进而改善其脂代谢异常[9]。鉴于马里苷对肝损伤的减缓作用以及其抗氧化应激和改善PPARα介导的脂质代谢异常的药理活性，本研究拟通过建立体内和体外AFL模型，探讨马里苷对AFL的影响，并从氧化应激和PPARα介导的脂质代谢2个角度探究其抗AFL的可能作用机制，为进一步研究马里苷的药理作用提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用的主要仪器有：Infinite M1000 Pro型全波长多功能酶标仪（瑞士Tecan公司），FJ-200型高速分散均质机（美国LI-COR公司），Power PAC 2000型电泳仪、ChemiDoc XRS 型自动凝胶成像系统、电泳槽（美国Bio-Rad公司），Fresco 21型高速微量台式冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司），CX31型倒置显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 主要药品与试剂

本研究所用的主要药品与试剂有：马里苷标准品（上海源叶生物科技有限公司，批号B29210，纯度≥98%），MK886（PPARα抑制剂）标准品（上海Med Chem Express公司，批号HY-14166，纯度≥99.7%），高度白酒（北京红星股份有限公司，酒精度：52%vol），油红O染色试剂盒（德国Sigma公司，批号MAK194），考马斯亮蓝蛋白、甘油三酯（triglyceride，TG）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为20230403、20230412、20230415、20230514），兔源PPARα抗体、兔源肉碱棕榈酰转移酶1（carnitine palmitoyltransferase-1，CPT-1）抗体、兔源二脂酰甘油酰基转移酶（diacylgly- cerol acyltransferase，DGAT）抗体和兔源β-肌动蛋白（β-actin）抗体（英国Abcam公司，批号分别为ab314112、ab220789、ab100982、ab8226），辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（武汉Proteintech公司，批号SA02502），ECL化学发光液（上海天能生命科学有限公司，批号180-5001）。

1.3 动物

实验动物为SPF级健康雄性昆明小鼠，共37只，体重20～22 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号为SCXK（沪）2022-0004。小鼠购入后，饲养于苏州大学SPF级动物房内，饲养环境温度为（22±2） ℃、相对湿度为 55%、12 h 光照/12 h 黑暗循环。实验动物所有操作均严格按照苏州大学动物伦理委员会标准执行（伦理批件号：SUDA20230622A01）。

1.4 细胞

大鼠BRL肝细胞购自中国科学院细胞库。将细胞接种于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中，并在饱和湿度、5%CO2、37 ℃培养箱中培养。

2 方法

2.1 动物实验

2.1.1 小鼠AFL模型建立及分组、给药

在进行正式实验前，小鼠进行环境适应性饲养2 d。然后按体重将小鼠随机分为正常对照组（n＝9）、模型组（n＝10）和马里苷75、150 mg/kg组（n＝9，给药剂量根据相关文献报道[10―11]及本课题组前期预实验结果确定；以0.5%羧甲基纤维素钠溶液为溶剂进行药液配制，马里苷母液质量浓度分别为3.75、7.5 mg/mL）。马里苷75、150 mg/kg组小鼠灌胃相应剂量的马里苷药液（0.02 mL/g），正常对照组和模型组小鼠灌胃等体积0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每天1次，持续30 d。每天完成给药30 min后，模型组和各给药组小鼠均采用高度白酒灌胃30 d的方法建立AFL小鼠模型[12]：初始灌胃剂量为0.01 mL/g，并在7 d内将剂量逐渐加大到0.015 mL/g；正常对照组小鼠灌胃相应剂量双蒸水。实验第30天取1只模型组小鼠，采用苏木素-伊红（HE）染色后观察其肝组织病理改变，以肝细胞出现脂滴沉积、脂肪空泡变性为造模成功判定标准。

2.1.2 取材及肝组织中TG、MDA和SOD水平测定

末次给药后，小鼠禁食不禁水12 h，称重。经眼球取血后，脱颈处死小鼠。取出小鼠肝脏，用冷生理盐水冲洗，滤纸吸干后，取大约0.3 g肝组织，加2.7 mL生理盐水制成10%肝组织匀浆，以4 000 r/min离心10 min；取上清，按照试剂盒说明书操作，测定肝组织中TG、MDA和SOD水平。另取部分肝组织置于10%甲醛溶液中固定，剩余肝组织置于－80 ℃冰箱中保存备用。

2.1.3 肝组织病理形态学观察

采用HE染色法进行观察。取“2.1.2”项下经10%甲醛溶液固定的肝组织（每只小鼠取的部位相同），常规操作制备石蜡切片（厚度4 μm）后行HE染色，在显微镜下观察肝组织脂肪浸润情况。

2.1.4 肝组织中PPARα、CPT-1和DGAT蛋白表达检测

采用Western blot法进行检测。取“2.1.2”项下冻存的肝组织（每组取3只小鼠样本），采用RIPA裂解液超声提取组织中总蛋白，测定总蛋白浓度后，调整样品体积，使各组上样量保持一致。将蛋白高温变性后，配制10%分离胶，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（电压80 V、电泳时间 20 min，电压 120 V、电泳时间 40 min），之后按90 V、90 min的转膜条件转移至NC膜，用5%脱脂奶粉封闭90 min；加入PPARα、CPT-1、DGAT和β-actin一抗（PPARα的稀释度为1∶500，CPT-1的稀释度为1∶300，DGAT和β-actin的稀释度为1∶1 000），4 ℃孵育过夜。洗膜后，加入对应二抗，室温孵育1 h。ECL 化学发光显影，采用 ChemiDoc XRS 凝胶成像系统进行信号扫描，利用Image J软件进行图像分析获取蛋白条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）条带灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。

2.2 细胞实验

2.2.1 马里苷对大鼠BRL肝细胞活力的影响

为筛选马里苷后续实验干预的浓度和时间，采用MTT法测定马里苷对正常BRL肝细胞活力的影响。取对数生长期的细胞，接种于96孔板中（铺板密度为1×105个/mL），置于CO2培养箱内培养 24 h 后，将细胞分为正常对照组、1‰二甲基亚砜（DMSO）组和马里苷3、6、12 μmol/L组（浓度参考文献[9]设置，以1‰DMSO为溶剂进行药液配制），每组设置3个复孔。各组细胞分别经空白培养基、含1‰DMSO的培养基、含药培养基处理24 h后，每个细胞培养孔加入20 μL MTT溶液作用4 h，吸取上清液，加入100 μL DMSO作用15 min后，利用全波长酶标仪测定490 nm波长下吸光度值，计算细胞相对活力：细胞相对活力＝（实验孔吸光度值－空白孔吸光度值）/（对照孔吸光度值－空白孔吸光度值）×100%。实验重复3次。

2.2.2 马里苷对乙醇诱导的肝细胞损伤的影响

取对数生长期的细胞，接种于6孔板中（铺板密度为1×104个/mL）。实验分为正常对照组、模型组、模型+1‰DMSO组和马里苷3、6、12 μmol/L组，每组设3个复孔。参考文献[13]方法并进行改良后建立酒精性肝细胞损伤模型：用0.5%乙醇、0.01%硫酸亚铁和0.1 μmol/L油酸刺激大鼠BRL肝细胞24 h致脂质堆积（采用油红O染色法观察肝细胞内脂滴的分布，观察到脂滴提示造模成功）。马里苷各浓度组在造模同时给予不同浓度的马里苷作用24 h。收集细胞，按照试剂盒说明书操作，测定肝细胞中TG、MDA和SOD水平，并参照“2.1.4”项下方法测定细胞中PPARα、CPT-1和DGAT的蛋白表达。实验重复3次。

2.2.3 MK886干预后马里苷对乙醇损伤肝细胞中PPARα、CPT-1和DGAT蛋白表达的影响

为进一步验证马里苷是否通过调控PPARα发挥作用，采用MK886处理细胞。取对数生长期的细胞，接种于6孔板中（铺板密度为1×104个/mL）。实验分为正常对照组、模型组、模型+MK886组、模型+MK886+马里苷12 μmol/L组，每组设3个复孔。MK886的给药浓度参考文献[14]设定为10 μmol/L，马里苷给药浓度根据“2.2.2”项下结果设定。正常对照组不处理，模型组按“2.2.2”项下方法建立酒精性肝细胞损伤模型，模型+MK886组造模的同时加入MK886，模型+MK886+马里苷12 μmol/L组造模的同时加入MK886和马里苷。培养24 h后收集各组细胞，按照“2.1.4”项下方法测定细胞中PPARα、CPT-1和DGAT的蛋白表达。实验重复3次。

2.3 统计学方法

采用GraphPad Prism软件作图和进行数据统计分析。符合正态分布的计量资料以±s表示，采用单因素方差分析和LSD-t法进行组间比较。检验水准α＝0.05。

3 结果

3.1 动物实验结果

3.1.1 马里苷对小鼠肝组织中TG、MDA和SOD水平的影响

与正常对照组比较，模型组小鼠肝组织中TG、MDA水平显著升高（P＜0.01），SOD水平显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，马里苷75、150 mg/kg组小鼠肝组织中TG、MDA水平显著降低（P＜0.05或P＜0.01），SOD水平显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。结果见表1。

表1 各组小鼠肝组织中TG、MDA和SOD水平测定结果（±s，n＝9）

表1 各组小鼠肝组织中TG、MDA和SOD水平测定结果（±s，n＝9）

a：与正常对照组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与模型组比较，P＜0.01。

SOD/（U/mg prot）220.73±45.13 163.49±8.91a 178.47±17.12b 193.30±26.88c组别正常对照组模型组马里苷75 mg/kg组马里苷150 mg/kg组TG/（mg/g）7.33±2.72 20.31±3.17a 14.95±3.26b 10.73±1.71c MDA/（nmol/mg prot）1.72±0.57 2.58±0.28a 1.99±0.40b 1.75±0.39c

3.1.2 马里苷对小鼠肝组织病理形态学的影响

正常对照组小鼠肝组织中肝细胞排列有序、整齐，肝小叶结构正常，肝细胞未见脂肪变性、炎症细胞浸润现象。模型组小鼠肝组织中肝细胞排列紊乱，肝小叶结构被破坏，分布有弥散性的脂质空泡。马里苷不同剂量组小鼠肝组织中脂肪变性的程度较模型组明显减轻，肝细胞的排列渐趋正常，肝小叶的结构有所恢复，尤以马里苷150 mg/kg组的改善更为明显。结果见图1。

图1 各组小鼠肝组织HE染色病理形态学观察图

3.1.3 马里苷对小鼠肝组织中PPARα、CPT-1和DGAT蛋白表达的影响

与正常对照组比较，模型组小鼠肝组织中PPARα、CPT-1的蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），DGAT蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，马里苷75、150 mg/kg组小鼠肝组织中PPARα、CPT-1蛋白表达水平显著升高（P＜0.05或P＜0.01），DGAT蛋白表达水平显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。结果见图2和表2。

图2 各组小鼠肝组织中PPARα、CPT-1、DGAT蛋白表达的电泳图

表2 各组小鼠肝组织中PPARα、CPT-1、DGAT蛋白表达水平测定结果（±s，n＝3）

表2 各组小鼠肝组织中PPARα、CPT-1、DGAT蛋白表达水平测定结果（±s，n＝3）

a：与正常对照组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与模型组比较，P＜0.01。

DGAT/β-actin 0.15±0.02 0.22±0.23a 0.19±0.01b 0.15±0.01c组别正常对照组模型组马里苷75 mg/kg组马里苷150 mg/kg组PPARα/β-actin 1.15±0.20 0.39±0.04a 0.64±0.05b 0.98±0.12c CPT-1/β-actin 0.96±0.11 0.55±0.09a 0.82±0.06c 0.83±0.12c

3.2 细胞实验结果

3.2.1 马里苷对正常大鼠BRL肝细胞活力的影响

与正常对照组[相对细胞活力为（100.00±0.00）%，n＝3]比较，1‰DMSO组和马里苷3、6、12 μmol/L组作用24 h后，细胞活力[分别为（99.21±6.42）%、（99.02±5.39）%、（96.24±5.98）%、（96.83±9.43）%，n＝3]均无显著变化（P＞0.05），因此该浓度可以用于后续实验。

3.2.2 马里苷对肝细胞脂质生成的影响

与正常对照组比较，模型组细胞中有较多被染成红色的脂滴，其分布在靠近细胞膜的区域，使整个细胞呈现出“印戒”状；与模型组比较，3、6、12 μmol/L马里苷作用后可显著减少细胞中红色脂滴分布，细胞轮廓变得清晰，且以马里苷12 μmol/L组细胞红色脂滴减少最明显。结果见图3。

图3 各组细胞的油红O染色观察结果

3.2.3 马里苷对肝细胞中TG、MDA和SOD水平的影响

与正常对照组比较，模型组细胞中TG、MDA水平显著升高（P＜0.01），SOD水平显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，模型+1‰DMSO组细胞中上述指标差异均无统计学意义（P＞0.05）；马里苷3、6、12 μmol/L组细胞中TG、MDA水平均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），SOD水平均显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。结果见表3。

表3 各组细胞中TG、MDA和SOD水平测定结果（±s，n＝3）

表3 各组细胞中TG、MDA和SOD水平测定结果（±s，n＝3）

a：与正常对照组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与模型组比较，P＜0.01。

SOD/（U/mg prot）56.98±6.89 23.37±6.41a 29.20±2.05 37.43±6.57b 43.30±6.55c 47.01±4.01c组别正常对照组模型组模型+1‰DMSO组马里苷3 μmol/L组马里苷6 μmol/L组马里苷12 μmol/L组TG/（mg/g prot）1.23±0.12 2.86±0.40a 2.34±0.52 1.74±0.22b 1.58±0.17c 1.55±0.15c MDA/（nmol/mg prot）1.34±0.13 3.50±0.62a 3.32±0.65 2.24±0.38b 1.82±0.21c 1.52±0.11c

3.2.4 马里苷对肝细胞PPARα、CPT-1和DGAT蛋白表达的影响

与正常对照组比较，模型组细胞中PPARα、CPT-1蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），DGAT蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，模型+1‰DMSO组细胞中上述指标水平差异均无统计学意义（P＞0.05）；马里苷3、6、12 μmol/L组细胞中PPARα、CPT-1蛋白表达水平显著升高（P＜0.05或P＜0.01），DGAT蛋白表达水平显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。结果见图4和表4。

图4 各组细胞中PPARα、CPT-1、DGAT蛋白表达的电泳图

表4 各组细胞中PPARα、CPT-1、DGAT蛋白表达水平测定结果（±s，n＝3）

表4 各组细胞中PPARα、CPT-1、DGAT蛋白表达水平测定结果（±s，n＝3）

a：与正常对照组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与模型组比较，P＜0.01。

DGAT/β-actin 0.20±0.02 1.02±0.09a 1.13±0.10 0.78±0.09b 0.64±0.08c 0.27±0.05c组别正常对照组模型组模型+1‰DMSO组马里苷3 μmol/L组马里苷6 μmol/L组马里苷12 μmol/L组PPARα/β-actin 0.78±0.05 0.25±0.05a 0.33±0.06 0.59±0.04b 0.60±0.09b 0.75±0.04c CPT-1/β-actin 0.23±0.05 0.12±0.02a 0.11±0.02 0.16±0.01b 0.18±0.02c 0.20±0.01c

3.2.5 MK886干预后马里苷对乙醇损伤肝细胞中PPARα、CPT-1和DGAT蛋白表达的影响

与正常对照组比较，模型组和模型+MK886组细胞中PPARα、CPT-1蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），DGAT蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，模型+MK886+马里苷12 μmol/L组细胞中上述指标水平差异均无统计学意义（P＞0.05），表明在用MK886预处理后，马里苷对乙醇诱导肝细胞中PPARα、CPT-1和DGAT蛋白表达的影响消失。结果见图5、表5。

图5 MK886干预后肝细胞中PPARα、CPT-1和DGAT蛋白表达的电泳图

表5 MK886干预后肝细胞中PPARα、CPT-1和DGAT蛋白表达水平测定结果（±s，n＝3）

表5 MK886干预后肝细胞中PPARα、CPT-1和DGAT蛋白表达水平测定结果（±s，n＝3）

a：与正常对照组比较，P＜0.01。

组别正常对照组模型组模型+MK886组模型+MK886+马里苷12 μmol/L组DGAT/β-actin 1.15±0.08 1.95±0.06a 2.07±0.08a 1.93±0.09 PPARα/β-actin 1.03±0.11 0.38±0.05a 0.23±0.05a 0.23±0.05 CPT-1/β-actin 0.72±0.19 0.30±0.11a 0.20±0.02a 0.21±0.03

4 讨论

乙醇可能会影响肝脏脂质代谢，并导致肝脏脂质蓄积和脂肪变性[15―16]。在本研究中，动物实验采取小鼠连续灌胃高度白酒30 d，细胞实验采取0.5%乙醇、0.01%硫酸亚铁和0.1 μmol/L油酸诱导大鼠BRL肝细胞损伤来进行药效研究。结果显示，在动物和细胞模型中均检测到肝细胞中TG水平显著增加，而在给予马里苷后，细胞中TG水平均显著下降，表明马里苷可拮抗乙醇引起的肝脏脂肪堆积。

研究表明，乙醇蓄积可导致活性氧自由基的大量产生，进而诱发机体的氧化应激和脂质过氧化反应，最终导致肝细胞损伤。而乙醇蓄积不但会引起活性氧自由基的大量产生，还会降低机体的抗氧化能力[17]。在本研究中，笔者检测了小鼠肝组织中MDA、SOD水平。结果发现，在马里苷作用后，小鼠肝组织中MDA水平显著降低，SOD水平显著升高；同时，在乙醇诱导的肝细胞中也检测到马里苷的上述作用。由此可知，马里苷可通过提高机体的抗氧化酶水平，增加对活性氧自由基的清除能力，从而减轻氧化应激引起的肝损伤。

PPARα是调节脂质代谢的一种重要的转录因子，主要在肝脏表达[18]。在乙醇蓄积的情况下，肝组织中PPARα表达被抑制，从而导致脂质代谢异常，使肝脏受损[3]。PPARα可通过调控其靶基因CPT-1和DGAT表达，在肝脏脂质代谢中发挥重要作用[19―20]。CPT-1是调控脂肪酸β氧化的关键酶，DGAT则是调控TG合成的关键酶，这2种酶的异常表达会导致脂质合成增加。在本研究中，动物实验和细胞实验结果均表明，乙醇诱导肝细胞损伤后会抑制PPARα蛋白表达，且CPT-1蛋白表达也随之下调，但DGAT蛋白表达却上调，这表明PPARα参与了乙醇引起的肝脂质代谢紊乱；而马里苷可上调乙醇诱导肝细胞中PPARα、CPT-1蛋白的表达，下调DGAT蛋白的表达。为了进一步验证马里苷对PPARα的靶向调控作用，本研究在采用MK886对肝细胞进行预处理后，观察到马里苷对细胞中PPARα、CPT-1和DGAT的调控作用被阻断，证实了马里苷改善乙醇诱导肝脏脂肪变性的作用可能是通过调控PPARα信号通路实现的。

综上所述，马里苷对AFL具有保护作用，其作用机制可能为增加肝脏的SOD水平以抑制乙醇引起的氧化应激，也可能是通过增强PPARα的表达进而调控其介导的脂质代谢相关靶蛋白CPT-1和DGAT的表达，但其更多的作用机制仍待进一步研究。