超高效液相色谱-串联质谱法同时测定水稻中氟酮磺草胺及其代谢物的残留

陈国峰，滕 瑶，刘 峰，张晓波，董见南，黄文功，兰 静

（黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所，黑龙江 哈尔滨 150086）

氟酮磺草胺（C14H13F3N4O5S），化学名称为2-［（4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基）羰基］-1，1，6′-三氟-N-甲基甲磺酰苯胺是由拜耳作物科学公司于2010 年开发的一种高效、低毒、高选择性的水田出苗前和出苗后磺酰胺除草剂［1-3］。该磺胺类除草剂是日本组合化学公司继嘧啶类除草剂之后开发的第2 种除草剂。氟酮磺草胺为乙酰乳酸合成酶（ALS）抑制剂，通过阻止缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成，抑制细胞分裂和分生组织生长，从而导致敏感杂草枯死［4］。该除草剂对水稻具有较高的选择性，可有效防治水稻田禾本科杂草、莎草和阔叶杂草，对水稻田难防杂草和对磺酰脲类产生抗性的杂草有效。

水稻（Oryza sativaL.）是水稻是世界上最主要的粮食作物之一［5］，目前，世界一半以上的人口、中国60%以上的人口以稻米为主食。水稻作为我国的四大主要粮食作物之一，水稻的安全生产关乎着整个国家粮仓的安全和社会的稳定［6］。然而在水稻的生产过程中，农药的使用却是必不可少的，特别是不合理不规范的农药使用会对水稻的生态环境产生严重的后果，从而对危害到水稻的安全消费，并通过食物链最终影响人类的生存安全［7-8］。

图1 氟酮磺草胺、BCS AA10030和BCS-CS64946结构式

目前国内外对于氟酮磺草胺的研究主要集中其以及复配剂型对水稻田杂草的防治效果上［9-13］，还有部分学者研究了氟酮磺草胺的施用对后茬作物的影响［14-15］， 肖祖菊等人研究了氟酮磺草胺悬浮剂的高效液相色谱质量分数测定［16］，Chen 等人研究了氟酮磺草胺在水中的光解及代谢产物的鉴定研究［17］。而目前对于能够同时测定水稻基质中氟酮磺草胺及其代谢物BCS AA10030 和BCS-CS64946 的方法却未见报道，并且没有能够系统的评估氟酮磺草胺及其代谢物在田间试验条件下的膳食风险评估。本研究的目的是（1）建立一种简单，快速，有效的分析方法，通过UPLC-MS/ MS 同时测定糙米、稻壳、秸秆中氟酮磺草胺及其代谢物BCS AA10030 和BCSCS64946 的残留量；（2）研究田间施用19%氟酮磺草胺悬浮剂在糙米中的最终残留；（3）评估氟酮磺草胺及其代谢物在膳食中的摄入风险。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 氟酮磺草胺（纯度98.7%）、BCS AA10030（97.8%）和BCS-CS64946（91.2%）。色谱纯乙腈、甲酸。分析纯的乙腈和氯化钠，超纯水（KHS-100 纯水仪制备）。石墨化碳黑（GCB）、N-（正丙基）乙二胺（PSA）、C18以及有机系滤膜（尼龙，0.22µm）。

X-TQD三重四级杆质谱，配有电喷雾离子源（ESI）美国Waters 公司；BT 2202 S 电子天平 德国赛多利公司；CF15RX 高速离心机 日本日立公司；HS501振荡器 德国IKA公司。

1.2 测定方法

1.2.1 样品前处理 分别称取糙米（10.0 g）、稻壳（2.0 g）和秸秆（2.0 g）样品于50 mL 离心管中，依次加入10 mL去离子水和20 mL乙腈，振荡30 min，加入3 g NaCl，涡旋10 min，以10 000 r/min的速度离心10 min，待净化。将1 mL糙米和稻壳上层乙腈相转移至称有50 mg PSA 的2 mL 离心管中，1 mL 秸秆上层乙腈相转移至称有25 mg GCB的2 mL 离心管中，涡旋1 min，10 000 r/min 离心3 min，取上清液经0.22 µm 有机系滤膜过滤，待测。

1.2.2 标准曲线配制 氟酮磺草胺及其代谢物BCS AA10030 和BCS-CS64946 的标样溶液配制：分别称取氟酮磺草胺标准品10.1 mg、BCS AA10030标准品10.2 mg、BCS-CS64946 标准品10.9 mg（精确值0.1 mg）于3 个不同的10 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度线，配制成1 000 mg/L 的标准储备液。将上述3 种化合物的工作液用乙腈稀释配得100 mg/L 的标准混合液，保存在4℃下直到使用。

1.2.3 仪器条件 配备有超高效液相色谱（HClass，Waters）的三重四极杆串联质谱仪（UPLCMS/MS；Agilent）分析氟酮磺草胺及其代谢物BCS AA10030 和BCS-CS64946。 配Acquity UPLC®BEH T3（50 mm×2.1 mm，1.8 µm）用于液相色谱分离，柱温为30℃，进样体积为10 µL，流速0.3 mL/min。流动相由0.1%的甲酸在水（A）和乙腈（B）的混合溶剂中组成。分离通过梯度洗脱，洗脱程序：0～1.0 min，10%B；1.0～1.2 min，10%～90%B；1.2～3.0 min，90%B；3.0～3.5 min，90%～10%B；3.5～5.0 min，10%B。离子源：电喷雾离子源ESI 源；扫描方式：正离子扫描；毛细管电压：3 KV；离子源温度：150℃；脱溶剂温度：350℃；脱溶剂气流量：650 L/h；锥孔气流量：50 L/h；检测方式：多重反应监测（MRM），（表1）。

表1 氟酮磺草胺及其代谢物的质谱参数

1.2.4 定量限（LOQ） 和检测限（LOD） 以3 倍的信噪比（S/N）来确定目标化合物的LOD，以最小添加回收浓度作为方法的定量限（LOQ）［18］。为了确定LOD，将混合的标准工作溶液（1.0 mL）在旋转蒸发仪中干燥，然后用糙米、稻壳和秸秆基质重新溶解并稀释，直到每种目标化合物的S/N 比为3。为了确定糙米、稻壳和秸秆中的氟酮磺草胺及其代谢物BCS AA10030和BCS-CS64946的LOQ，将一系列糙米、稻壳和秸秆样品加标最低浓度的工作溶液（0.01 mg/L），按照上述的方法进行提取和净化，逐级稀释直至目标化合物的S/N比为10。

1.2.5 正确度和精密度测定 将混有氟酮磺草胺及其代谢物BCS AA10030和BCS-CS64946的标准溶液分别添加3 组浓度到空白糙米、稻壳和秸秆样品中，每档浓度重复5 次，用上述分析方法测定并计算相对标准偏差。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的确定 根据已经配制好的氟酮磺草胺及其代谢物BCS AA10030和BCS-CS64946溶剂标准工作溶液，根据其分子结构，通过适当的正离子或者负离子的模式对其进行母离子扫描，结合其分子量，确定母离子的质核比。通过调节仪器的锥孔电压来优化母离子响应的最大化。同时通过对碰撞室增加氩气并通过调节碰撞能量来选择子离子，选择在一定的碰撞能量下最稳定和响应值最高的两个分别对两个子离子进行碰撞能量的优化，找到子离子响应最大时的碰撞能量，最后选择响应较高的子离子作为定量子离子，使仪器灵敏度达到最佳［19］。氟酮磺草胺及其代谢物BCS AA10030和BCS-CS64946的母离子、锥孔电压、子离子、碰撞电压（表1），溶剂标准工作溶液谱图（图2）。

图2 氟酮磺草胺及其代谢物BCS AA10030和BCS-CS64946的溶剂色谱图

2.2 提取与净化 本研究对氟酮磺草胺及其代谢物BCS AA10030 和BCS-CS64946 的提取溶剂甲醇、丙酮、50%乙腈水、纯乙腈进行了优化。用混合标准溶液加标糙米、稻壳和秸秆的粉碎样品中，以使上述3 种介质中氟酮磺草胺及其代谢物BCSAA10030和BCS-CS64946的含量均为0.1mg/kg。（图3）使用甲醇对氟酮磺草胺、BCS AA10030 和BCS-CS64946 这3 种化合的提取率在67.2%～78.4%之间；丙酮对上述3 种化合物的提取率在101.5%～110.07%之间，这可能与丙酮能够提取糙米中的大多数物质，且此类脂类物质对氟酮磺草胺、BCS AA10030 和BCS-CS64946 的定性和定量均有基质增强的效应；纯乙腈的提取率在80.8%～89.4%之间，而50%乙腈水的提取率则在98.2%～100.1%之间。因此，50%乙腈水是提取糙米中氟酮磺草胺、BCS AA10030和BCS-CS64946的最佳溶剂，因为乙腈不仅能够可有效提取大多数样品中大多数农药及其代谢物残留，且与目标化合物一起提取出来且影响其定性和定量结果的杂质较少，最为重要的是，加入50%水和氯化钠之后能够产生盐析的作用，最终达到去除部分水溶性杂质的目的。

图3 优化氟酮磺草胺及其代谢物BCS AA10030和BCS-CS64946提取溶剂

目前，最主流的高效、便捷、迅速的前处理方法QuECHERS 中PSA，GCB，C18等是其最常用的分散固相萃取材料［20-21］。分别想10.0 g 糙米、2.0 g 稻壳和秸秆样品中加入氟酮磺草胺、BCS AA10030 和BCS-CS64946 混合标准储备液，使得上述3 个化合物在糙米、稻壳和秸秆中的浓度均为0.1 mg/kg，先后加入20 mL蒸馏水，20 mL乙腈，振荡提取30 min，加入5 g NaCl，再振荡10 min，3 500 r/min 离心5 min，取上层乙腈提取液1 mL，在其中分别加入25、50、75、100 mg 的PSA、GCB 和C18研究其使用量对其基质溶液的净化效果，其具体结果（表2）。在上述糙米的1 mL乙腈提取液中C18随着使用量的增加回收率逐渐提高，当到达50 mg 时，氟酮磺草胺、BCS AA10030 和BCS-CS64946 的回收率达到最高，≥96.7%，随着C18使用量逐渐增加，其回收率逐渐降低，这可能与C18的理化性质有关，C18能够很好的吸附提取液中的非极性杂质，而氟酮磺草胺、BCS AA10030 和BCS-CS64946 的极性也在极性和非极性之间，因此也会对氟酮磺草胺、BCS AA10030和BCS-CS64946 进行吸附。在上述糙米提取液中，当PSA 的用量在达到100 mg 时，上述3 种化合物的回收率才能达到最高，为95.7%。当1 mL稻壳提取物中的回收率也呈现随着PSA 含量的增加而逐渐提高并趋缓的规律，当PSA 的含量为50 mg 时，回收率和成本达到最优的一个状态，出现此类的情况主要是因为PSA 净化剂含有两个氨基能够有效去除样品中影响质谱测定的色素、酸类和糖类等极性的杂质，且对目标农药和代谢物不具有吸附效果，降低了基质对信号响应的抑制。当每1 mL 秸秆基质提取液中用25 mg GCB 提取时，氟酮磺草胺、BCS AA10030和BCS-CS64946的回收率在91.6%～96.7%之间，当GCB 使用量的逐渐增加，其回收率均低于71.6%，上述的结果表明GCB在能够有效的吸附杂质的同时也吸附了目标化合物氟酮磺草胺、BCS AA10030 和BCS-CS64946。同时方法的准确性和使用的成本，分别使用50 mg C18、50 mg PSA 和25 mg GCB分别净化糙米、稻壳和秸秆中的杂质（表2）。

表2 糙米、稻壳和秸秆提取溶液中净化剂PSA，C18和GCB的优化

2.3 方法验证 通过氟酮磺草胺及其代谢物BCS AA10030 和BCS-CS64946 标准溶液浓度与定量离子峰面积作标准曲线，（表3）中显示了乙腈中氟酮磺草胺、BCS AA10030 和BCS-CS64946 的回归分析结果，相关系数（R）均＞0.997 0，这表明氟酮磺草胺、BCS AA10030 和BCS-CS64946在0.001～0.5 mg/L范围内线性良好。

表3 氟酮磺草胺、BCS AA10030和BCS-CS64946的标准曲线和LOD

由表3 可见，在上述条件下，氟酮磺草胺在乙腈溶剂、糙米、稻壳和秸秆中的最低检出量在5.9×10-4～1.7×10-3ng 之间，BCS AA10030 的最低检 出 量 在1.0×10-3～3.7×10-3ng 之 间，而BCSCS64946 的最低检出量在7.0×10-3～2.2×10-2ng 之间。本研究以最小添加回收浓度作为方法的定量限，在上述色谱条件下氟酮磺草胺及其代谢物BCS AA10030 和BCS-CS64946 在糙米、稻壳和秸秆中的最低检出浓度均为0.01 mg/kg。

通过重复（n=5）测量3 种不同分析物浓度下的回收率来评估该方法的准确性。糙米中氟酮磺草胺及其代谢物BCS AA10030 和BCS-CS64946的平均回收率为96.9%～101.8%，相对标准偏差（RSD）分别为1.2%～5.6%（表4）。稻壳中上述3 种化合物的平均回收率在88.4%和103.0%之间，其相对标准偏差（RSD）在0.9%和6.8%之间。秸秆中氟酮磺草胺、BCS AA10030 和BCSCS64946 的平均回收率为90.3%～102.7%，相对标准偏差（RSD）在0.8%和9.3%之间。以上结果表明，该方法的精密度，重现性和灵敏度足以同时定量测定糙米、稻壳和秸秆中的氟酮磺草胺及其代谢物BCS AA10030和BCS-CS64946残留。

表4 氟酮磺草胺及其代谢物BCS AA10030和BCS-CS64946的添加回收率

3 结论

本研究建立的一种能够同时测定水稻糙米、稻壳和秸秆中的氟酮磺草胺及其代谢物BCS AA10030 和BCS-CS64946，该方法具有简单、高效、便捷、灵敏等优点。该方法同时具有回收率高，准确性高和可重复性强等优点。该方法完全能够满足农药残留分析要求，适用于大量水稻样品中氟酮磺草胺及其代谢物BCS AA10030 和BCS-CS64946 的快速检测，为政府监管提供有效的检测分析手段。