孔石莼多糖无花果果酒酿造工艺优化及其抗氧化活性研究

丛懿洁

（威海海洋职业学院 食品与药品系，山东 威海 264300）

孔石莼（Ulva pertusaKjellm）属绿藻门石莼科石莼属，是一种可食用的大型绿藻[1]。在黄、渤海地区产量非常丰富，是威海沿海地区分布较广泛的野生海藻[2]。孔石莼中含有丰富的多糖，包括纤维素多糖、水溶性阴离子多糖及淀粉等。孔石莼多糖具有抗氧化、抗菌、抗病毒、降血糖、降胆固醇以及治疗心脑血管等疾病的作用。徐军[3]对石莼多糖的提取及其抗氧化活性研究发现，石莼多糖对羟基自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的半抑制浓度（half maximal inhibitory con centration，IC50）值分别为2.4 mg/mL和11.5 mg/mL，具有较强的抗氧化活性。冯学珍等[1]优化石莼多糖的提取工艺并测定其清除DPPH自由基的IC50值为0.87 mg/mL。

无花果（Ficus caricaL.）属于小浆果，其因花朵从内膨大构成果实本体、花位于果内而具有特殊性。《圣经》中无花果被美称为“神圣之果”、“生命之果”[4]。无花果果软肉嫩，酸甜可口，富含多种活性成分，如活性多糖、黄酮、多酚、过氧化歧化酶、花青素、维生素C等。DEL CARO A等[5]研究发现，无花果果皮中几乎覆盖了所有的酚类物质。VEBERIC R等[6]研究发现，无花果中富含黄酮类物质，如槲皮素芸香糖苷、芦丁、花色素苷、表儿茶素等。孙小华[4]研究无花果果酒的抗氧化性，发现无花果的总抗氧化能力、对DPPH自由基清除率与羟自由基抑制率随着果酒发酵时间延长整体呈现升高趋势。另外，无花果还含有佛手柑内酯、补骨脂素、苯甲醛等抗癌成分，具有健脾益胃、润肺止咳、解毒消肿等功效[7]。

目前，无花果因保存期较短，大部分新鲜食用，少部分被加工成无花果干、无花果酱等，市面关于无花果酒的产品相对较少。本试验拟以山东威海地产无花果为原料，添加孔石莼多糖，制备孔石莼多糖无花果果酒，采用单因素和响应面法对其发酵条件进行优化，并对其抗氧化活性进行研究，以期对孔石莼等海藻类资源、无花果的精深加工提供思路，对当地经济发展起到促进作用[8-9]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

孔石莼：取自威海海边；无花果：山东威海大型超市；体积分数95%乙醇：东莞市勋业化学试剂有限公司；纤维素酶（1.8×105U/g）：日本天野酶制品株式会社；果酒酵母：安琪酵母股份有限公司；果胶酶（5×104U/g）：上海华上翔洋生物技术有限公司；偏重亚硫酸钾（食品级）：天津市天大化工实验厂；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：日本东京化成工业株式会社；2,2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate），ABTS）（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；维生素C：维克奇生物科技有限公司；柠檬酸（食品级）：河北拓海生物科技有限公司；白砂糖：市售。

1.2 仪器与设备

FSD-100粉碎机：郑州中谷机械设备有限公司；JY96-IIN超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司；DZW-6020真空干燥箱：上海铂温仪器有限公司；QQM500D台式低速离心机：上海启前电子科技有限公司；JGG均质机：温州市利宏机械科技有限公司；TJE06A榨汁杯：浙江苏泊尔股份有限公司；HH-US 恒温水浴箱：江苏新春兰科学仪器有限公司；PAL-109酒精浓度计：阜阳菲勒科技有限公司；JC-400-SE恒温培养箱：青岛精诚仪器仪表有限公司；MIK-PH8.0 pH计：杭州美控自动化技术有限公司；LH-T55手持糖度仪：浙江陆恒环境科技有限公司；FA1204B电子天平：青岛聚创世纪环保科技有限公司；UV-2600紫外可见分光光度计：日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 孔石莼多糖提取

将孔石莼清洗，烘干、粉碎，用体积分数95%的乙醇浸泡48 h后过滤，烘干得脱脂孔石莼[10-11]。将烘干后的孔石莼粉碎制得粉末，过60目筛。向孔石莼粉末按料液比1∶50（g∶mL）加水，并加入500 U/g纤维素酶，于50 ℃条件下超声40 min提取孔石莼多糖。沸水浴15 min，钝化酶活。200目绢布过滤提取液，3 000 r/min离心10 min，取上清液。将上清液进行真空浓缩，加入体积分数95%的乙醇进行醇沉，摇匀，静置6 h，1 500 r/min离心5 min，得孔石莼多糖沉淀。加入适量的水溶解，真空浓缩干燥48 h。将干燥好的样品研磨成粉末状置于4 ℃冰箱里，备用[12-13]。

1.3.2 孔石莼多糖无花果果酒酿造工艺流程及操作要点

新鲜无花果→酶解、打浆→调整成分→接种发酵→陈酿→成品

操作要点[14-15]：

选取新鲜、无破损、成熟度较好的威海青皮无花果为原料，清洗、去蒂、切分后，添加2倍无花果质量的水，用榨汁机打浆约2 min，打浆时添加0.02%的柠檬酸护色，打浆后立即加入0.02%偏重亚硫酸钾，进行抑菌。随后向无花果浆中加入0.3%的果胶酶，45 ℃水浴酶解2 h，90 ℃灭酶5 min。冷却后过滤，5 000 r/min条件下离心15 min，得到无花果汁。

向无花果汁中添加适量的白砂糖调节初始糖度，添加柠檬酸调节pH值为3.4左右。随后添加一定量的孔石莼多糖。取1 g干酵母加入10 mL 2%葡萄糖溶液中，混合均匀后于37 ℃活化30 min备用。在90 ℃水浴条件下灭菌5 min，冷却至室温后添加一定量经活化后的酿酒酵母菌种，混匀后入罐发酵（入罐前用SO2熏罐），在一定的温度条件下发酵一定时间，至液体逐渐澄清，酒精度不再发生变化，终止发酵。在4 ℃条件下陈酿30 d，添加2%的皂土溶液进行澄清，用100目的滤布进行过滤，而后灌装得到孔石莼多糖无花果果酒成品。

1.3.3 孔石莼多糖无花果果酒发酵条件优化

（1）单因素试验

在初始糖度22°Bx，酵母接种量0.04%，孔石莼多糖添加量0.3%，发酵温度26 ℃，发酵时间8 d的条件下，以感官评分和酒精度为评价指标，改变单一因素，分别考察初始糖度（18°Bx、20°Bx、22°Bx、24°Bx、26°Bx）、酵母接种量（0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%）、孔石莼多糖添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、发酵温度（22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃）、发酵时间（6 d、7 d、8 d、9 d、10 d）对孔石莼多糖无花果果酒品质的影响。

（2）响应面试验

根据单因素试验结果，选择初始糖度（A）、酵母接种量（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）为4个因素，以果酒感官评分（Y1）和酒精度（Y2）为响应值，设计4因素3水平Box-Behnken试验优化孔石莼多糖无花果果酒发酵条件。响应面试验因素与水平见表1。

表1 孔石莼多糖无花果果酒发酵条件优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation conditions optimization of Ulva pertusa polysaccharide fig fruit wine

1.3.4 测定方法

（1）感官评价标准[16]

按照GB/T 16291.1—2012《感官分析选拔、培训与管理评价员一般导则第1部分：优选评价员》[17]对评价员进行筛选和培训，最终选取10名优选评价员。结合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[18]，根据果酒的特点，确定果酒的外观、香气、滋味、典型性为感官评价指标。10名优选评价员从4个方面对孔石莼多糖无花果果酒进行感官评价，满分为100分，最终结果取10人的平均分，具体评分标准见表2。

表2 孔石莼多糖无花果果酒感官评分标准Table 2 Sensory evaluation standards of Ulva pertusa polysaccharide fig fruit wine

（2）抗氧化活性测定

①DPPH自由基清除率的测定[19]：分别取0.05 mL、0.07 mL、0.09 mL、0.11 mL、0.13 mL、0.15 mL、0.17 mL果酒样品于具塞比色管中，用纯水补充至2 mL，加入0.2 mmol/L DPPH溶液2.0 mL摇匀，室温条件下避光反应30 min，取上清液于波长517 nm处测定吸光度值A1；同时取相同系列体积的果酒样品，用纯水补充至2mL，加入2 mL无水乙醇溶液混合均匀，在波长517 nm处测定吸光度值A2；以2 mL无水乙醇溶液和2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液混合后在波长517 nm处测定吸光度值A0为空白对照；以0.2 mg/mL维生素C溶液作阳性对照。DPPH自由基清除率计算公式如下：

②ABTS自由基清除率[20]：分别取0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL、0.35 mL果酒样品于具塞比色管中，用纯水补充至2 mL，加入ABTS工作液2 mL摇匀，室温条件下避光反应20 min，于波长734 nm处测定吸光度值Ai；以纯水替代样品为空白对照，测定吸光度值A0；以0.2 mg/mL 维生素C作阳性对照。ABTS自由基清除率计算公式如下：

（3）理化及微生物指标测定

酒精度：参照GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》中的酒精计法[21]；总糖、总酸：参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[18]；pH值：pH计测定；菌落总数：参照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[22]；大肠菌群：参照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》[23]。

1.3.5 数据处理

采用SPSS 22.0统计分析，采用Origin 9.0作图，采用Design-Expert 13.0进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 孔石莼多糖无花果果酒发酵条件优化单因素试验

2.1.1 初始糖度对孔石莼多糖无花果果酒品质的影响

在酵母接种量0.04%，孔石莼多糖添加量0.3%，发酵温度26 ℃，发酵时间8 d的条件下，考察初始糖度对孔石莼多糖无花果果酒品质的影响，结果见图1。

图1 初始糖度对孔石莼多糖无花果果酒品质的影响Fig. 1 Effects of initial sugar degree on the quality of Ulva pertusa polysaccharide fig fruit wine

由图1可知，随着初始糖度的升高，孔石莼多糖无花果果酒的感官评分和酒精度均呈现先升高后略有降低的趋势，而残糖量先缓慢增加而后快速上升。当初始糖度达到22°Bx时，孔石莼多糖无花果果酒的感官评分和酒精度均到最高，分别为93.5分和11.8%vol，而此时残糖量呈快速上升的拐点。在发酵过程中，当初始糖度较低时，酵母完全利用了体系中的糖进行繁殖，糖不足导致酒精度较低，达不到正常果酒的口感，此时制备的果酒的感官评分和酒精度均较低。随着初始糖度的升高，环境体系能够充分满足酵母的增长和繁殖。当初始糖度进一步升高，过高糖度开始抑制酵母繁殖，使发酵不完全，产生的酒精较少，产品的口感也开始变差[24]。因此，选择最佳初始糖度为22°Bx。

2.1.2 酵母接种量对孔石莼多糖无花果果酒品质的影响

在初始糖度22 °Bx，孔石莼多糖添加量0.3%，发酵温度26 ℃，发酵时间8 d的条件下，考察酵母接种量对孔石莼多糖无花果果酒品质的影响，结果见图2。

图2 酵母接种量对孔石莼多糖无花果果酒品质的影响Fig. 2 Effects of yeast inoculation on the quality of Ulva pertusa polysaccharide fig fruit wine

由图2可知，随着酵母接种量的增加，孔石莼多糖无花果果酒的感官评分和酒精度均呈现先升高后降低的趋势。当酵母接种量＜0.04%时，随着酵母接种量的增加，孔石莼多糖无花果果酒的感官评分和酒精度均逐渐升高；当酵母接种量达到0.04%时，孔石莼多糖无花果果酒的感官评分和酒精度均最高，分别为94.3分和12.1%vol；当酵母接种量＞0.04%时，随着接种量的继续增加，孔石莼多糖无花果果酒的感官评分和酒精度逐渐降低，此时因酵母接种量较大，酵母自身大量繁殖和产生的代谢物抑制酒精的产生，感官品质也因此受到影响[25]。残糖量在酵母接种量为0.02%～0.06%范围内呈现下降趋势，由于酵母接种量越多，越有利于酵母将糖类物质充分分解。因此，选择最佳酵母接种量为0.04%。

2.1.3 孔石莼多糖添加量对孔石莼多糖无花果果酒品质的影响

在初始糖度22°Bx，酵母接种量0.04%，发酵温度26 ℃，发酵时间8 d的条件下，考察孔石莼多糖添加量对孔石莼多糖无花果果酒品质的影响，结果见图3。

图3 孔石莼多糖添加量对孔石莼多糖无花果果酒品质的影响Fig. 3 Effects of Ulva pertusa polysaccharide addition on the quality of Ulva pertusa polysaccharide fig fruit wine

由图3可知，随着酵母接种量的增加，孔石莼多糖无花果果酒的感官评分呈现先升高后降低的趋势。当孔石莼多糖添加量＜0.3%时，随着多糖添加量的增加，孔石莼多糖无花果果酒的感官评分随之增加；当孔石莼多糖添加量达到0.3%时，感官评分达到最高为93.8分；当孔石莼多糖添加量＞0.3%，随着多糖添加量的继续增加，可能由于孔石莼多糖累积到一定程度对果酒风味产生影响，因此感官评分下降。孔石莼添加量对孔石莼多糖无花果果酒的酒精度影响不显著（P＞0.05），当孔石莼多糖添加量从0.1%增加至0.5%时，产品的酒精度大致稳定在11.6%vol～12.0%vol。残糖量呈现逐渐上升趋势。综合感官评分和酒精度两个指标，选择孔石莼多糖最佳添加量为0.3%。

2.1.4 发酵温度对孔石莼多糖无花果果酒品质的影响

在初始糖度22 °Bx，酵母接种量0.04%，孔石莼多糖添加量0.3%，发酵时间8 d的条件下，考察发酵温度对孔石莼多糖无花果果酒品质的影响，结果见图4。

图4 发酵温度对孔石莼多糖无花果果酒品质的影响Fig. 4 Effects of fermentation temperature on the quality of Ulva pertusa polysaccharide fig fruit wine

由图4可知，随着发酵温度的升高，孔石莼多糖无花果果酒感官评分和酒精度整体呈现先升高后降低的趋势，而残糖量呈下降趋势。当发酵温度较低时，酵母生长缓慢，酒精积累不足，酒香气不足，感官评分较低；当发酵温度达到26 ℃时，孔石莼多糖无花果果酒感官评分和酒精度均达到最高，分别为94.5分和12.1%vol；当发酵温度高于26 ℃时，酵母大量繁殖消耗糖分，酒精度下降，同时因营养成分消耗完导致酵母菌死亡，使酒体产生浑浊现象，影响产品的感官品质，感官评分下降[26]。因此，选择最佳发酵温度为26 ℃。

2.1.5 发酵时间对孔石莼多糖无花果果酒品质的影响

在初始糖度22 °Bx，酵母接种量0.04%，孔石莼多糖添加量0.3%，发酵温度26 ℃的条件下，考察发酵时间对孔石莼多糖无花果果酒品质的影响，结果见图5。

图5 发酵时间对孔石莼多糖无花果果酒品质的影响Fig. 5 Effects of fermentation time on the quality of Ulva pertusa polysaccharide fig fruit wine

由图5可知，随着发酵时间延长，孔石莼多糖无花果果酒感官评分和酒精度整体呈现先升高后降低的趋势。当发酵时间较短时，果酒的酒精度不够，口感较差，感官评分较低；当达到第8天时，孔石莼多糖无花果果酒的感官评分达到最高为94.5分，此时果酒发酵充分，有较好的果香气、酒香气以及果酒正常的口感；随着发酵时间的继续延长，酒精度稳定，但酒体产生较多的代谢产物使感官评分明显下降。当发酵时间＜8 d时，发酵不充分，酒精度不够；在第8天时，酒精度达到最高为11.7%vol；当发酵时间＞8 d时，酒精度不再增高，保持稳定状态，此后体系中产酒能力已达到最大值。残糖量随着发酵时间的延长而逐渐下降。因此，选择最佳发酵时间为8 d。

2.2 孔石莼多糖无花果果酒发酵条件优化响应面试验

在单因素试验基础上，采用Design-Expert 13.0设计响应面试验，试验设计及结果见表3，方差分析结果见表4。

表3 孔石莼多糖无花果果酒发酵条件优化响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface for fermentation conditions optimization of Ulva pertusa polysaccharide fig fruit wine

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert 13.0对表3试验结果进行多元二次回归拟合，得到孔石莼多糖无花果果酒感官评分和酒精度的回归方程如下：

Y1=93.54+1.71A+1.78B+1.45C+1.74D+1.83AB+0.2AC-0.75AD+4.3BC+0.63BD-1.30CD-8.29A2-8.70B2-4.43C2-4.29D2

Y2=11.82-0.43A+0.28B+0.63C+0.35D+0.08AB+0.38AC-0.75AD+0.60BC+0.28BD-0.15CD-0.78A2-1.44B2-1.18C2-0.47D2

由表4可知，感官评分和酒精度的两个回归模型均为极显著（P＜0.000 1）；且失拟项P（感官评分）=0.055 5和P（酒精度）=0.194 5，均不显著。说明感官评分（Y1）、酒精度（Y2）两项回归方程拟合度均较好，可以用其对试验结果进行估算[27]。

感官评分回归方程的决定系数R2=0.964 1，调整决定系数R2Adj=0.928 2，即92.82%的试验数据可以用该模型进行分析，即模型中92.82%的孔石莼多糖无花果果酒的感官评分变化来自于此试验中的自变量A、B、C、D。通过F值得到影响产品感官评分的各因素顺序为酵母接种量（B）＞发酵时间（D）＞初始糖度（A）＞发酵温度（C）。由P值可知，一次项A、B、C、D和交互项BC及二次项A2、B2、C2、D2对感官评分的影响呈极显著（P＜0.01），交互项AB对感官评分的影响呈显著（P＜0.05），其他项不显著（P＞0.05）。

酒精度回归方程的决定系数R2=0.930 0，调整决定系数R2Adj=0.860 0，即86%的试验数据可以用该模型进行分析，即模型中86%的孔石莼多糖无花果果酒的酒精度变化来自于此试验中的自变量A、B、C、D。通过F值得到影响产品酒精度的各因素顺序为发酵温度（C）＞初始糖度（A）＞发酵时间（D）＞酵母接种量（B）。由P值可知，一次项A、C和二次项A2、B2、C2对酒精度的影响呈极显著（P＜0.01），一次项B、D和交互项BC及二次项D2对酒精度的影响呈显著（P＜0.05），其他项不显著（P＞0.05）。

变异系数（coefficient of variation，CV）（感官评分）=2.02%和CV（酒精度）=4.04%，说明试验的稳定性较高。信噪比（感官评分）=18.527 9和信噪比（酒精度）=12.011 3，均大于4，表明试验的可信度比较高。综合来看，感官评分和酒精度的两个回归模型拟合度均较好，试验操作可信度均较高，都能够较准确地预测果酒相应的品质[28]。

根据单因素试验，在最优单因素条件下，果酒的酒精度大致稳定在11.4%vol～12.1%vol，满足果酒酒精度的基本要求，同时根据评价员反馈，在此范围的酒精度变化对产品口感影响不大。评价员更加关注果酒的香气、滋味、典型性等感官品质，因此选择以感官评分作为响应值进行响应面试验并分析。各交互因素的响应曲面见图6。

图6 各因素间交互作用对孔石莼多糖无花果果酒感官评分及酒精度影响的响应曲面和等高线Fig. 6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on the sensory score and alcohol content of Ulva pertusa polysaccharide fig fruit wine

由图6可知，响应面的曲面坡度较陡，等高线呈椭圆形，即酵母接种量与初始糖度、酵母接种量和发酵温度间的交互作用对感官评分影响较大，响应曲面和等高线结果与回归模型方差分析一致。

Design-Expert 13.0软件对回归方程进行最优求解得出，孔石莼多糖无花果果酒理论预测的最佳发酵条件为：初始糖度21.865°Bx，酵母接种量0.042%，发酵温度26.239 ℃，发酵时间8.264 d，在此条件下，孔石莼多糖无花果果酒的理论预测感官评分为94.026分，酒精度为12.027%vol。

结合实际生产条件，修订孔石莼多糖无花果果酒发酵条件为初始糖度22°Bx，酵母接种量0.04%，发酵温度26 ℃，发酵时间8 d，其他因素不变，在该条件下进行3次平行试验，孔石莼多糖无花果果酒的感官评分为93.8分，酒精度为11.8%vol，与理论预测值相差较小。因此，此试验模型可以用于优化孔石莼多糖无花果果酒的发酵工艺。

2.3 孔石莼多糖无花果果酒抗氧化试验结果

由图7（a）可知，当样品体积＜0.11 mL时，随着样品量的增加，孔石莼多糖无花果果酒和维生素C样品的DPPH自由基清除率均逐渐升高；当样品体积＞0.11 mL时，孔石莼多糖无花果果酒和维生素C样品的DPPH自由基清除率均趋于平稳，最大值分别达到94.4%和97.4%。对于相同体积的样品，果酒对DPPH自由基清除能力低于维生素C。

图7 孔石莼多糖无花果果酒对DPPH（a）及ABTS（b）自由基清除率的影响Fig. 7 Effects of DPPH (a) and ABTS (b) free radical scavenging rates of Ulva pertusa polysaccharide fig fruit wine

由图7（b）可知，当样品体积＜0.2 mL时，随着样品量的增加，孔石莼多糖无花果果酒和维生素C样品的ABTS自由基清除率均逐渐升高；当样品体积＞0.2 mL时，孔石莼多糖无花果果酒和维生素C样品的ABTS自由基清除率均趋于平稳，最大值分别达到95.8%和97.6%。对于相同体积的样品，果酒的ABTS自由基清除能力低于维生素C[29]。表明孔石莼多糖无花果果酒对DPPH、ABTS自由基有一定的清除作用。

2.4 孔石莼多糖无花果果酒的理化和微生物指标

最佳发酵条件下制备的孔石莼多糖无花果果酒各项理化、微生物指标测定结果见表6。

表6 孔石莼多糖无花果果酒理化和微生物指标Table 6 Physicochemical and microbiological indexes of Ulva pertusa polysaccharide fig fruit wine

由表6可知，孔石莼多糖无花果果酒总糖含量（以葡萄糖计）为（53.8±0.79）g/L、总酸（以酒石酸计）含量为（3.8±0.11）g/L、菌落总数＜1 CFU/mL、大肠菌群未检出，各项指标均符合NY/T 1508—2017《绿色食品果酒》[30]的相关规定。

3 结论

该研究采用单因素和响应面法对孔石莼多糖无花果果酒的发酵条件进行优化，得到最佳发酵条件为初始糖度22°Bx，酵母接种量0.04%，孔石莼多糖添加量0.3%，发酵温度26 ℃，发酵时间8 d。在此条件下得到的孔石莼多糖无花果果酒澄清、透亮、有光泽，具有无花果的典型性，酒味醇厚，香气怡人，感官评分为93.8分，酒精度为11.8%vol。孔石莼多糖无花果果酒的DPPH和ABTS自由基清除率分别达到94.4%和95.8%，表明研制的果酒具备一定的抗氧化能力。本研究结果为威海等沿海地区海藻类、无花果等资源深加工提供一定思路，具备一定的产业化开发价值。