核桃紫米酸奶的研制及其品质分析

牟泓羽，李菜兰，吴 波，陈 蓉，盛 军，赵存朝，，4*，余智瑾

（1.云南农业大学 食品科学技术学院 云南 昆明 650201；2.云南省高原特色农业产业研究院，云南 昆明 650201；3.云南农业大学 食药同源资源开发利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650201；4.云南农业大学 精准营养与个性化食品制造教育部重点实验室，云南 昆明 650201；5.昆明生物制造研究院有限公司，云南 昆明 650201）

植物基酸奶与普通酸奶是基于截然不同的原料制成[1]，普通酸奶是牛奶或羊奶等动物基为原料，植物基酸奶则采用大豆、坚果等植物基发酵而成。与传统动物基发酵而成的酸奶相比，植物酸奶由于丰富的原料来源，因此具有更加独特的味道、全新的营养组成以及特殊的功能。核桃中富含蛋白质、脂肪、维生素、矿物质和膳食纤维，以及酚类等活性成分，营养价值较高[2]。

核桃的不饱和脂肪酸和蛋白质含量高，氨基酸组成全面，其中赖氨酸含量相对较低[3]。核桃蛋白是一种优质的植物蛋白，消化率和净蛋白比值较高[4]。紫米在云南、贵州等地有少量种植，是稀有的彩色稻米资源[5]，蛋白质、氨基酸、矿物质等物质还含有多种黄酮、酚类、花青素等生物活性化合物[6]，具有抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗氧化、降血糖和抗过敏等活性，这些活性与预防疾病和促进健康有关，使紫米在食品和医药领域具有更大的潜力[7-8]。国外植物基市场比国内成熟，国内植物基市场还处于布局阶段，植物基酸奶发展潜力巨大，传统的代乳制品主要以大豆为原料，随着消费者需求的增加，新型原料种类不断增加，如燕麦、大米等谷物类，巴旦木、杏仁等坚果类[9]。目前已有以核桃为原料制作酸奶的报道及研究[10-11]，但核桃发酵后的风味不甚理想，限制了核桃酸奶的发展[12]，而紫米特有的稻香能够很好地掩盖核桃发酵后的不良味道，通过紫米的添加，不仅丰富了其营养价值，在风味及口感也上更易于接受，然而目前关于紫米酸奶的研究报道比较少，将紫米与核桃结合制作纯植物基酸奶的研究更是鲜见报道。鉴于紫米和核桃含有丰富的营养物质，有必要对核桃紫米酸奶的工艺进行优化研究。

本研究以核桃和紫米为原料，白砂糖、椰子水、菜籽油为辅料，采用植物乳杆菌进行发酵，研制出一款酸甜可口、口感独特的常温植物基酸奶，并对其品质进行分析。这不仅可以丰富植物基酸奶的种类，满足消费者对口味多样化及营养价值的追求，还可以把云南巨大的自然资源转化为经济优势，为云南的核桃和紫米产业深加工提供开发思路，同时也为国内常温植物基酸奶的发展提供参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验原料

紫米：镇沅彝族哈尼族拉祜族自治县金穗粮油加工有限责任公司；核桃仁：楚雄康记农业发展有限公司；白砂糖：昆明多悦多工贸有限公司；椰子水：文昌椰海食品有限公司；羧甲基纤维素（carboxymethyl cellulose，CMC）：尚天生物科技有限公司；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）：丹麦科汉森公司。

1.1.2 实验试剂

氢氧化钠、硫酸铜、甲基红溴甲酚绿指示剂：天津市凤船化学试剂科技有限公司；酚酞指示剂：上海碧云天生物技术有限公司；MRS培养基：广东环凯微生物科技有限公司：试验所用化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

JJ-6A-6H六联电动恒温搅拌器：常州智博瑞仪器制造有限公司；LRH-150F生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；JM-F80胶体磨：温州左佳机械科技有限公司；KDN-08消化炉、KDN-08（04B）定氮仪：上海力辰邦西仪器科技有限公司；SX-2.5-12箱式电阻炉：北京市永光明医疗仪器有限公司；ACQUITY液相色谱仪：美国Waters公司；AB4000质谱仪：上海爱博才思分析仪器贸易有限公司；TRACE 1300气相色谱仪、ISQ 7000质谱仪：赛默飞世尔科技公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃紫米酸奶制作工艺及操作要点

操作要点：

浸泡：将紫米和核桃仁清洗后，用纯净水浸泡4 h，利于磨浆和熬煮。

紫米熬煮：浸泡好的紫米加入适量清水，先用大火煮开，再用小火熬煮至紫米无白色米心。

磨浆：浸泡好的核桃仁和熬煮过的紫米，加水混匀后，用胶体磨3 000 r/min细磨15 min，磨至无明显大颗粒，组织状态细腻均匀即可。

混料、杀菌：将白砂糖、椰子水、菜籽油和羧甲基纤维素加入磨好并预热至60 ℃的原料浆内，加水定容混匀后，95 ℃杀菌20 min，冷却即得核桃紫米乳。

接种、发酵：将核桃紫米乳冷却至34 ℃，添加0.5%的植物乳杆菌，于34 ℃培养12 h。

灭菌、灌装：再加热至65 ℃巴氏杀菌30 min后，灌装即为核桃紫米酸奶成品。

1.3.2 核桃紫米酸奶制备条件优化单因素试验

以核桃紫米酸奶总质量为基准，基础条件设置为去皮核桃仁添加量13%、紫米添加量12%、白砂糖8%、椰子水0.75%、菜籽油0.25%、羧甲基纤维素（CMC）0.3%，植物乳杆菌发酵剂0.05%，发酵时间14 h。在此基础上进行单因素试验，以感官评分和理化指标为评价指标，研究核桃仁添加量（11%、12%、13%、14%、15%）、紫米添加量（10%、11%、12%、13%、14%）、CMC添加量（0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%）和发酵时间（12 h、13 h、14 h、15 h、16 h）对核桃紫米酸奶品质的影响，确定各因素的适宜范围。

1.3.3 核桃紫米酸奶制备条件优化响应面试验

以单因素试验为依据，利用响应面Box-Behnken设计试验，选取对酸奶品质影响较大的核桃仁添加量、紫米添加量和发酵时间为自变量，感官评分为响应值，设计3因素3水平的响应面试验，得到核桃紫米酸奶制作的最佳工艺条件。响应面试验因素与水平见表1。

表1 核桃紫米酸奶制备条件优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for preparation conditions optimization of walnut and purple rice yogurt

1.3.4 核桃紫米酸奶感官评定

核桃紫米酸奶的感官评分标准参照GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》和T/WSJD 12—2020《植物蛋白饮料植物酸奶》制定，分别从色泽、气味、滋味及组织状态四个方面进行综合评判。邀请10名经过感官评价训练的师生，按表2标准进行综合评分（满分100分），结果取平均值。

表2 核桃紫米酸奶的感官评分标准Table 2 Sensory evaluation standards of walnut and purple rice yogurt

1.3.5 产品指标测定

（1）理化指标的测定

酸度的测定：参照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》；可溶性固形物的测定参考QB/T 4221—2011《谷物类饮料》；蛋白质的测定参考GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法；脂肪的测定参考GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》中酸水解法；灰分的测定参考GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》。

持水力（water holding capacity，WHC）的测定：称量离心管质量（M1），取20 g样品放入离心管（M2），4 000 r/min离心10 min，再静置10 min后，去除上清液，称量剩余质量（M3）。持水力的计算公式为：WHC=（M3-M1）/（M2-M1）×100%。

（2）脂肪酸的测定

脂肪酸的测定采用气质联用法[13]。

气相色谱条件：Thermo TG-FAME毛细管柱（50 m×0.25 mm，0.20 μm）；分流进样，进样量1 μL，分流比8∶1。进样口温度250 ℃；离子源温度300 ℃；传输线温度280 ℃。程序升温起始温度80 ℃，保持1 min；以20 ℃/min升至160 ℃，保持1.5 min；以3 ℃/min升至196 ℃，保持8.5 min；最后以20 ℃/min升至250 ℃，保持3 min。载气为氦气（He），载气流速0.63 mL/min。

质谱条件：ThermoISQ 7000质谱仪，电子轰击电离（electronimpactionization，EI）源，SIM扫描方式，电子能量70eV。

（3）氨基酸的测定

氨基酸的测定采用液相色谱串联质谱法[14]。

液相色谱条件：采用ACQUITY UPLCR BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），进样量5 μL，柱温35 ℃，流动相A-50%甲醇水（含0.1%甲酸），B-10%甲醇水（含0.1%甲酸）。梯度洗脱条件为0～6.5 min，90～70%B；6.5～7 min，70～0% B；7～14 min，0% B；14～14.5 min，0～90% B；14.5～17.5 min，90%B。流速0～8.0 min，0.3 mL/min；8.0～17.5 min，0.4 mL/min。

质谱条件：电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）源，正离子电离模式。离子源温度500 ℃，离子源电压5 500 V，碰撞气4 psi，气帘气40 psi，雾化气和辅助气均为50 psi。采用多重反应监测进行扫描。

脂肪酸及氨基酸定性定量分析：通过保留时间和峰形信息对不同样品中的化合物质谱峰进行积分校正，以确保定性和定量分析的准确性。通过比对标准品和苏州帕诺米克生物医药科技有限公司自建数据库对样品中各化合物进行分析鉴定。通过峰面积归一法对得到的各化合物进行相对定量，计算每种组分的峰面积与峰面积总和的比值，作为各化合物的相对含量。

1.3.6 数据处理

所有试验数据平行测定3次，试验结果均以“平均值±标准差”表示；用SPSS23.0对试验数据进行平均值及标准差计算，利用Design-Expert8.0.6对试验工艺参数进行响应面分析，采用TBtools及Origin 2021进行聚类和主成分分析并绘图。

2 结果与分析

2.1 核桃紫米酸奶制备条件优化单因素试验

核桃仁、紫米、CMC添加量及发酵时间对产品感官评分和酸度的影响结果见图1。由图1A可知，随着核桃仁添加量增大，感官评分先上升后下降，而滴定酸度先上升后趋于平缓。当核桃仁添加量＜13%时，核桃香味不明显，滋味不够丰富，核桃仁添加量为13%时，感官评分最高，为（86.7±0.95）分，该条件下制得的核桃紫米酸奶，浓稠度适宜，口感较好，核桃香味明显。随着核桃仁含量的增多，其酸度略有上升，涩味及粗糙感也随之增加[15]，感官评分呈现下降趋势，此外核桃仁含量增加，核桃香味会掩盖紫米的香味，酸奶滋味单一，使得感官评分较低。故最佳核桃仁添加量为13%。

图1 不同影响因素对酸奶品质的影响Fig. 1 Effect of different influencing factors on yogurt quality

由图1B可知，随着紫米添加量不断增大，感官评分表现为先上升后下降，而酸度呈现递增的趋势。酸度的增加，可能是因为紫米中的低聚糖等成分成为了乳酸菌的发酵基料，促进了其产酸能力[16]。在核桃紫米酸奶中，紫米添加量＞12%时，酸奶过于黏稠，口感及组织状态不佳，当紫米添加量＜12%时，酸奶较稀，紫米香味不够浓郁。紫米添加量为12%时，酸奶口感较好，浓稠度适宜，感官评分最高，为（89.29±0.83）分。故最适紫米添加量为12%。

由图1C可知，当CMC添加量在0.2%～0.3%时，感官评价、滴定酸度随CMC添加量的增加而增加，当CMC添加量为0.3%时，感官评分最高，为（86.28±0.38）分，酸度为（49.3±0.37）°T。当CMC添加量＞0.3%之后，感官评分下降、酸度下降后缓慢回升。这是因为稳定剂添加过少，植物蛋白不稳定[17]，酸奶品质状态不好。而稳定剂添加过多，酸奶黏度过高，口感不佳，感官评分亦降低。故CMC的最佳添加量为0.3%。

由图1D可知，随着发酵时间不断加长，其感官评分表现为先上升后下降的变化，而滴定酸度则呈现递增的趋势。当发酵时间过短时，微生物产酸不完全，酸奶风味不足，而发酵时间过长时，微生物产生的乳酸过多，酸奶酸度增加，口感过酸，甚至导致酸奶变质，影响酸奶品质，整体风味不佳[18]。发酵时间为14 h时，其感官评分最高，为（86.03±0.29）分，酸度为（49.58±0.82）°T，此条件下制得的酸奶，酸甜适宜，发酵风味独特，整体风味最佳。故最佳发酵时间为14 h。

2.2 核桃紫米酸奶制备条件优化响应面试验

以单因素试验为依据，选取核桃仁添加量（A）、紫米添加量（B）和发酵时间（C）3个对核桃紫米酸奶口感风味影响较大的因素为自变量，以感官评分（Y）为响应值，利用Box-Benhnken对核桃紫米酸奶进行响应面试验优化试验，进行17组试验，试验方案及结果见表3，方差分析结果见表4。

表3 核桃紫米酸奶制备条件优化响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface plots for preparation conditions optimization of walnut and purple rice yogurt

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression models

通过Design Expert 8.0.6软件对表4中的试验数据进行多元非线性回归拟合，得到感官评分（Y）对核桃仁添加量（A）、紫米添加量（B）、发酵时间（C）的二次回归方程为：

Y=+86.27-1.59A+0.0825B-0.9138C+0.855AB+0.0825AC-1.01BC-1.51A2-3.80B2-3.88C2

由表4可知，回归模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），表明模型拟合度较高。决定系数为0.988 6，调整决定系数为0.973 9，表明此模型对实际试验方法拟合度和预测性都较好，适合紫米核桃酸奶发酵工艺。变异系数=0.85%，说明试验模型重现性较好。由P值可知，一次项A、C，交互项BC，二次项A2、B2、C2对感官评分影响极显著（P＜0.01），交互项AB对感官评分影响显著（P＜0.05）。由F值可知，影响酸奶发酵的工艺条件因素为A＞B＞C，即核桃仁添加量＞紫米添加量＞发酵时间。说明通过该多元回归方程模型得到的优化试验结果可靠性高，可用该模型分析和预测酸奶的感官评分。

通过Design-Expert 8.0.6软件分析回归方程，得出核桃紫米酸奶的最佳制备工艺条件为：核桃仁添加量12.46%、紫米添加量11.97%、发酵时间13.88 h，在此条件下酸奶感官评分预测值为86.76分。依据实际条件，将最佳工艺条件调整为：核桃仁添加量12.5%、紫米添加量12%、发酵时间14 h，采用该最佳工艺条件重复3次实验操作，结果取平均值，得到酸奶的感官评分实际值为86.87分，酸度为49.05°T。表明真实值与模型预测值之间的拟合性较好，说明将感官评分作为响应值，利用响应面法优化的工艺参数可行。

2.3 核桃紫米酸奶发酵前后品质分析

2.3.1 脂肪酸分析

脂肪酸对酸奶风味具有重要贡献，大量研究发现乳酸菌发酵前后会使脂肪酸成分会发生变化[19]。核桃紫米酸奶发酵前后脂肪酸含量的测定结果见表5，脂肪酸组成热图见图2。

图2 核桃紫米酸奶与核桃紫米乳脂肪酸的聚类分析Fig. 2 Cluster analysis of milk fatty acids in walnut and purple rice yogurt and walnut and purple rice milk

表5 核桃紫米酸奶与核桃紫米乳脂肪酸组成Table 5 Fatty acids composition of walnut and purple rice yogurt and walnut and purple rice milk

由表5及图2可知，通过发酵，核桃紫米酸奶总脂肪酸含量下降了14.52%，饱和脂肪酸含量占比下降3.59%，单不饱和脂肪酸含量占比上升了33.03%。两种样品中共检测出36种脂肪酸，其中亚油酸含量最高，其次为油酸、α-亚麻酸、顺-11-二十碳烯酸、硬脂酸和棕榈酸。将样本进行聚类分析可以看出，两者之间存在一定差别[20]。核桃紫米乳中饱和脂肪酸含量（5.01%）略高于核桃紫米酸奶中不饱和脂肪酸含量（4.83%），但核桃紫米乳氨基酸总量却高于核桃紫米酸奶。富含饱和脂肪酸的食物会增加血清胆固醇，增加心血管疾病的风险[21]，由结果可以看出，通过发酵，饱和脂肪酸的含量降低，进而降低相关疾病的发病率[22]。其中，二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）仅在核桃紫米酸奶中检测到。EPA具有降血脂及防止动脉粥样硬化的作用，并对心血管疾病具有积极的代谢作用[23]。此外单不饱和脂肪酸通过发酵，含量占比得到提高。但多不饱和脂肪酸的含量占比有所下降，发酵过程可能是导致其含量比例下降的主要原因。多不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸比值是评价油脂质量的重要指标，其最低值应在0.45左右[24]。核桃紫米酸奶中多不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸明显高于0.45，表明核桃紫米酸奶中脂肪酸的比例是合理的。

2.3.2 氨基酸分析

蛋白质水解生成为多肽，再将多肽转化为氨基酸加以利用，这是乳酸菌最重要的代谢活动之一[25]。对核桃紫米酸奶发酵前后氨基酸含量的变化进行测定，结果见表6。

表6 核桃紫米酸奶与核桃紫米乳氨基酸组成Table 6 Amino acid composition of walnut and purple rice yogurt and walnut and purple rice milk

由表6可知，核桃紫米乳的总氨基酸含量要高于核桃紫米酸奶，这可能与微生物生长消耗部分氨基酸，生成挥发性酸、胺等含氮物质有关[26]。游离氨基酸是核桃乳的主要风味物质，对核桃乳的风味形成起着重要作用。天冬氨酸和谷氨酸是类似于味精的成分，能给核桃乳带来鲜味，丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸和丙氨酸有一种令人愉悦的甜味，而异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和组氨酸则有苦味[27]。样品的主要风味氨基酸是甜味氨基酸，其占比分别为（31.34±1.73）%、（24.92±0.87）%，其次是鲜味氨基酸和苦味氨基酸；对比两种样品不难发现，通过发酵，鲜味和苦味氨基酸含量的占比下降，而甜味氨基酸含量占比上升，而氨基酸谱的变化会影响核桃乳的风味，从而改善其口感。对样品的氨基酸含量占比进行对比，结果见图3。

图3 核桃紫米酸奶与核桃紫米乳的21种氨基酸对比Fig. 3 Comparison of 21 amino acids between walnut and purple rice yogurt and walnut and purple rice milk

由图3可知，从两种样品中共鉴定出21种氨基酸，核桃紫米酸奶和核桃紫米乳中氨基酸含量占比最多的是丙氨酸，其次是γ-氨基丁酸、谷氨酸和精氨酸组氨酸，其他游离氨基酸含量较少，其中高半胱氨酸只在核桃紫米乳中检测到。与核桃紫米乳相比，核桃紫米酸奶中γ-氨基丁酸、甘氨酸和脯氨酸含量上升，但有一部分氨基酸尤其是必需氨基酸含量下降，这可能是因为，植物乳杆菌在发酵过程中，一些复杂的反应，如酶转化，氨基酸被分解，从而导致氨基酸含量下降[28]。综上所述，核桃紫米酸奶发酵后，氨基酸组成发生了变化，其中苦味氨基酸占比下降了20.23%，甜味氨基酸占比上升了25.76%。

2.3.3 核桃紫米酸奶中脂肪酸及氨基酸主成分分析

对氨基酸及脂肪酸组分进行主成分分析（principle component analysis，PCA），更直观地分析了核桃紫米酸奶与核桃紫米乳品质的差别，核桃紫米酸奶与核桃紫米乳氨基酸及脂肪酸组分的主成分分析结果见图4。

图4 核桃紫米酸奶与核桃紫米乳氨基酸及脂肪酸组分的主成分分析结果Fig. 4 Principle component analysis results of amino acid and fatty acid components of walnut and purple rice yogurt and walnut and purple rice milk

由图4可知，PC1和PC2的方差贡献率分别为68.9%和20.1%，累计方差贡献率达到89%，可以解释原变量信息中的大部分变异[29-30]。其中甜味氨基酸和单不饱和脂肪酸含量占比与核桃紫米酸奶的综合品质呈正相关，这与它们的含量占比在核桃紫米酸奶中最高相一致。同样的，鲜味氨基酸、苦味氨基酸和饱和脂肪酸等对核桃紫米乳的综合品质也有显著贡献。两种酸奶之间差异明显，可用PCA进行有效区分。

2.4 理化指标测定

根据优化后的最佳工艺配方制得核桃紫米酸奶，对其理化指标进行测定，结果见表7。

表7 紫米核桃酸奶指标测定结果Table 7 Determination results of indexes of purple walnut yoghurt

由表7可知，酸奶色泽均匀，酸甜度适中，并有核桃和紫米的香味，状态细腻、黏度适中，未出现分层现象。产品的酸度49.05 °T，蛋白质含量3.02 g/100 g，脂肪含量5.36 g/100 g，固形物含量29.09 g/100 g，菌落总数＜20 CFU/mL，未检出致病菌。由表7可知，核桃紫米酸奶各项指标均符合T/WSJD 12—2020《植物蛋白饮料植物酸奶》要求。

3 结论

本研究以核桃和紫米为原料，通过植物乳杆菌发酵，得到常温植物基核桃紫米酸奶，以单因素和响应面试验优化酸奶工艺，得到的最佳工艺条件为：核桃仁添加量12.5%、紫米添加量12%、发酵时间14 h。在此条件下核桃紫米酸奶的感官评分为86.87分，酸甜适口，浓稠度适宜，具有良好的组织状态及风味。通过品质分析可以看出，通过发酵，改变了样品氨基酸及脂肪酸的组成，不仅增加了不饱和脂肪和甜味氨基酸的占比，还减少了苦味氨基酸等对口感有不良影响物质的占比，使得核桃紫米酸奶有了更好的营养价值及更让人们接受的口感。