水中粪大肠菌群的测定- 酶底物法与荧光光度法的比较

张 茵，刘溪南，王 静，刘 娟

（1.河北省生态环境监测中心，河北 石家庄 050035；2.中国南水北调集团中线有限公司 河北水质监测中心，河北 石家庄 050035；3.石家庄高新技术产业开发区供水排水公司，河北 石家庄 050035）

0 引 言

粪大肠菌群又称耐热大肠菌群，44.5 度培养24 h，能产生β- 半乳糖甘酶，分解选择性培养基中的邻硝基苯-β-D 吡喃半乳糖甘生成黄色的邻硝基苯酚的肠杆菌科细菌。粪大肠菌群目前常用检测方法有：多管发酵法、滤膜法、纸片法和酶底物法。

其中滤膜法主要用于杂质较少的水样，与多管发酵法相比，检测相对简单，也需要进行验证实验。

荧光光度法原理：粪大肠菌群与各特性培养基反应，生成疏水荧光产物，释放出荧光，以此原理来测定水样中粪大肠菌群菌落数的方法。

目前该方法已在2014 年通过美国环境保护局EPA 标准用于检测水中粪大肠菌群（40 CFR Part 141），同时在2014 通过美国分析化学家协会AOAC 标准用于检测水中粪大肠菌群。

本文采用荧光光度法种方法检测不同梯度浓度的定量微生物质控(NSI-QC)菌株，采用酶底物和荧光光度法种方法检测石家庄、唐山、温州等不同地区的不同类型（生活饮用水、水源水、污水、景观用水） 的样品，按照数理统计规则进行数据分析，通过比对数据判断荧光光度法的准确度和两种方法的相关性。

1 操作步骤

1.1 试剂和器材

粪大肠菌群培养基：Fecal Coliform Agar（简称：Tectalert FCA）、100 mL 检测瓶、定量微生物质控(NSI-QC)菌株、灭菌后的生理食盐水等耗材、大肠菌群荧光检测仪购自爱德士公司。定量盘、程控封口机、科立德试剂、100 mL 样品瓶（均购于爱德士公司）；ZXGP-B2080 隔水式恒温培养箱（上海智诚分析仪器制造有限公司） 温控精度为±0.5 ℃。

1.2 试验步骤

1.2.1 高浓度定量微生物质控(NSI- QC)样品的制备

定量微生物质控(NSI-QC)菌株从-10 ℃冰箱取出,首先在室温下平衡温度10 ～15 min，随后将质控菌株转移入预先准备好的100 mL 灭菌后的生理食盐水中，轻轻振荡，待全部溶解后，将10 mL样品加入90 mL 无菌生理食盐水中作10 倍稀释，在水合作用30 min 内进行检测，分别采用酶底物法和荧光光度法测定浓度值。

1.2.2 低浓度定量微生物质控(NSI- QC)质控样品制备

定量微生物质控(NSI-QC)菌株从-10 ℃冰箱取出，首先在室温下平衡温度10 ～15 min，随后将质控菌株转移入预先准备好的100 mL 灭菌后的生理食盐水中，轻轻振荡，待全部溶解后，稀释10倍，在水合作用30 min 内进行检测，分别采用酶底物法和荧光光度法测定浓度值。

1.2.3 实际样品采集

根据日常检测的数据分别采集石家庄、唐山、邢台、江门、温州等不同地区水源水（地表水）、景观水、污水等，分别用两种方法进行测定。

1.2.4 荧光光度法测定水中粪大肠菌群

将100 mL 待测样品加入在检测瓶中加入2 g培养基（Tectalert FCA） 放置于大肠菌群荧光检测仪中，选择测定粪大肠菌群。根据浓度自动读取数据（检测时间2 ～18 h）。

1.2.5 酶底物法测定水中粪大肠菌群

酶底物法检测步骤参照《水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法》（HJ1001-2018），培养温度44.5 ℃，24 h，样品变为黄色判断为粪大肠菌群。

2 试验结果分析

2.1 不同浓度耐热总大肠定量微生物质控(NSIQC)检测结果

将不同浓度粪大肠菌群定量微生物质控(NSI-QC)质控样品用荧光光度法平行检测6 次。将结果与定量质控的真值范围进行比较，所有结果均在定量质控的真值范围内，合格率为100%。

荧光光度法测定中浓度定量微生物质控(NSI-QC)样品的检测结果见表1。

表1 荧光光度法测定中浓度定量微生物质控(NSI-QC)样品的检测结果Table1 Results of quantitative microbiological quality control(NSI-QC)samples in fluorometric determination

荧光光度法测定低浓度定量微生物质控(NSI-QC)样品的检测结果见表2。

表2 荧光光度法测定低浓度定量微生物质控(NSI-QC)样品的检测结果Table 2 The results of lowconcentration quantitative microbiological quality control(NSI-QC)samples were determined by fluorimetry

荧光光度法测定高浓度定量微生物质控(NSI-QC)样品的检测结果见表3。

表3 荧光光度法测定高浓度定量微生物质控(NSI-QC)样品的检测结果Table 3 The results of high concentration quantitative microbiological quality control(NSI-QC)samples were determined by fluorimetry

由不同梯度的质控浓度测定结果可以得出结论，荧光光度法测定粪大肠菌群的结果在质控范围内，准确度满足相关要求。

2.2 实际样品及加标水样检测结果方法比对分析

分别从全国不同地区选择水源水（地表水）、景观水、污水等及灭菌水，用荧光光度法和酶底物法同时对样品进行检测。为进一步探究两种方法在检测样品 时是否存在差异性运用软件SPSS Statistics 软件对滤膜法和光度法的检测结果进行t检验分析,为了使检测结果呈正态分布，将检测结果作对数处理后再进行t 检验分析，结果如表5 所示。通过对数据进行统计分析，说明荧光光度法与酶底物法具有高度一致性。

水源水数据分析（地表水） 见表4。

表4 水源水数据分析（地表水）Table 4 Source water data analysis(surface water)

景观水数据分析见表5。

表5 景观水数据分析Table 5 Analysis of landscape water data

污水数据分析见表6。

表6 污水数据分析Table 6 Sewage data analysis

2.3 数据处理

对表4 ～6 数据酶底物法和荧光光度法检测结果进行配对T 检验，为了使数据呈正态分布，对数据进行对数处理后再进行配对T 检验。由以上数据可知样品测定值经过计算，P=0.078＞0.05，说明酶底物法和荧光光度法的结果无显著性差异，具有统计学意义。

配对样本检验结果见表7。

表7 配对样本检验结果Table 7 Results of paired samples

2.4 无菌环境与有菌环境检测结果

取灭菌后的生理食盐水14 组，用荧光光度法在无菌环境和有菌环境中进行测定，测定结果均为阴性。实验结果见表8。

表8 无菌环境下荧光光度法测定灭菌后的生理食盐水结果Table 8 Determination of saline solution after sterilization by fluorimetry in a sterile environment

有菌环境下荧光光度法测定灭菌后的生理食盐水结果见表9。

表9 有菌环境下荧光光度法测定灭菌后的生理食盐水结果Table 9 Determination of saline solution after sterilization by fluorimetry in a sterile environment

3 讨 论

3.1 定量微生物质控(NSI-QC)样品检测结果分析

通过分别采用荧光光度法和酶底物法对高、中、低不同浓度的NSI 粪大肠菌群定量质控样品检测结果分析，二者相差不大，具有等效性。

3.2 实际样品及阴性样品检测

对水源水（地表水）、景观水、污水等样品进行检测后，对数据进行统计分析，t 检验结果为P=0.078（＞0.05），说明酶底物法和荧光光度法的检测结果无统计学差异，均可有效检测水中粪大肠菌群数。

荧光光度法检测无菌生理食盐水无菌环境和有菌环境下下，检测结果均为阴性，说明荧光光度法无需在专业无菌室环境操作，节省了实验室建设成本的同时也满足了应急检测的需求。

3.3 荧光光度法优缺点

（1） 荧光荧光光度法测定数据时间较短（2 ～18 h 即可得出检测结果）

（2） 荧光光度法可以自动计数，规避了由于酶底物观察时间不同、对结果测定结果判断误差引起的读数偏差。

（3） 荧光光度法测定范围范围广，最高108·100 mL-1。

酶底物法和荧光光度法优缺点比较见表10。

表10 酶底物法和荧光光度法优缺点比较Table 10 Compare the advantages and disadvantages of enzyme substrate method and fluorescence method

4 结 论

（1） 荧光光度法测定不同梯度浓度定量微生物质控(NSI-QC)样品，测定结果均在不确定度范围内，说明该方法的准确度满足测定要求。

（2） 2 种方法检测结果无明显差距，具有等效性。

（3） 荧光光度法测定范围广（最高可测定108 CFU/100 mL）。

（4） 自动读取实验数据，规避了由于读取时间不同对测定结果的影响，更适合实验室日常检测和应急检测。