塞来昔布关键中间体HPLC 含量测定方法的建立

刘晓莲

（河北冀衡药业股份有限公司，河北 衡水 053400）

0 引 言

塞来昔布（Celecoxib），化学名4-[5- （4- 甲基苯基） -3- （三氟甲基） 吡挫-1- 基]苯磺酰胺，是临床中常用的新一代环氧化酶-2（COX-2） 的特异性抑制剂，由美国西尔药厂研制开发，可通过抑制环氧化酶-2 阻止炎性前列腺素类物质的产生，属于非甾体抗炎药，表现出优异的抗炎镇痛作用，可显著减少胃肠道不良反应，用于治疗各类急、慢性关节炎和类风湿性关节炎等炎性疾病。无论对于急性创伤外伤导致的急性疼痛，还是外科手术后的止痛，都是理想的镇痛药物。

目前关于塞来昔布合成的文献和专利已有不少，在塞来昔布的合成工艺中，一般以对甲基苯乙酮和三氟乙酸乙酯经Claisen 缩合反应制得中间体，然后与对肼基苯磺酰胺盐酸盐反应制得塞来昔布，因此对肼基苯磺酰胺盐酸盐的质量检测对塞来昔布的合成来说有着至关重要的作用。但目前关于中间体的液相色谱检测方法的报道较少。本研究建立了对肼基苯磺酰胺盐酸盐的含量的高效液相色谱（HPLC） 测定方法，并对其进行了验证。

1 对肼基苯磺酰胺盐酸盐结构式

对肼基苯磺酰胺盐酸盐结构式如图1 所示。

图1 对肼基苯磺酰胺盐酸盐结构式Fig.1 Structural formula of 4-Hydrazinobenzene-1-sulfonamide hydrochloride

2 主要仪器与试剂

UltiMate 3000 型高效液相色谱，购自赛默飞世尔科技（中国） 有限公司；PURELAB flex 型超纯水仪，购自威立雅水处理技术（上海） 有限公司；BSA224S 型电子分析天平，购自赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司；KQ-250DB 型数控超声波清洗器，购自昆山市超声仪器有限公司。

对肼基苯磺酰胺盐酸盐对照品，购自河北蒲葵生物医药科技有限公司；对肼基苯磺酰胺盐酸盐对照品，河北冀衡药业股份有限公司自制；辛烷磺酸钠，购自天津市大茂化学试剂厂；三氟乙酸，购自天津市大茂化学试剂厂；色谱纯乙腈，购自美国迪马科技有限公司；水为超纯水。

3 方法与结果

3.1 色谱条件

色谱柱：Agllent ZORBAX SB-C18 柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；

流动相：缓冲液（1.65 g 庚烷磺酸钠置于1 000 ml 容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，用三氟乙酸调pH 值至2.5）：乙腈=88：12；

进样量：20 μL；

检测波长：233 nm；

流速：1.0 mL/min；

柱温：25℃。

3.2 溶液配置

供试品溶液制备方法：精密称取对肼基苯磺酰胺盐酸盐自制样品10.0 mg，置25.0 mL 量瓶中，用流动相溶解，并加流动相至刻度，摇匀，即得。对照品溶液制备方法：精密称取对肼基苯磺酰胺盐酸盐对照品10.0 mg，置25.0 mL 量瓶中，用流动相溶解，并加流动相至刻度，摇匀，即得。

3.3 系统适应性实验

按照2.2 项下制备方法配制6 份供试品溶液，按照上述色谱条件进行分析，记录色谱图。系统适用性结果见表1。

表1 对肼基苯磺酰胺盐酸盐含量测定HPLC 方法系统适用性试验结果Table 1 System suitability test results for determination of 4-Hydrazinobenzene- 1-sulfonamide hydrochloride content by HPLC method

由表1 可得，对肼基苯磺酰胺盐酸盐含量测定的保留时间的RSD＜2%，峰面积的RSD＜2%，拖尾因子为1.1，理论塔板数均在，10 000 以上表明该方法系统适用性良好。

3.4 方法学考察

3.4.1 线性范围对肼基苯磺酰胺盐酸盐的工作浓度是0.4 mg/mL，其线性测量范围为0.2 ～0.6 mg/mL，相当于工作浓度的50%～150%水平。取对肼基苯磺酰胺盐酸盐对照品约100 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，当做线性贮备溶液（2.0 mg/mL）。依次精密量取对肼基苯磺酰胺盐酸盐对照品贮备液适量，加流动相制成对肼基苯磺酰胺盐酸盐含量分别为0.2、0.32、0.4、0.48和0.6 mg/mL 浓度的对照品溶液，依照2.1 项色谱条件，各个浓度进样2 次，进行检测分析，分析后记录色谱图。

对肼基苯磺酰胺盐酸盐线性测定结果见表2。

表2 对肼基苯磺酰胺盐酸盐线性测定结果Table 2 Linearity determination results of 4-Hydrazinobenzene- 1-sulfonamide hydrochloride

对肼基苯磺酰胺盐酸盐含量测定标准曲线如图2 所示。

图2 对肼基苯磺酰胺盐酸盐含量测定标准曲线Fig.2 The standard curve determination of 4-Hydrazinobenzene-1-sulfonamide hydrochloride

由表2 可见，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，其线性回归方程：y=0.241 6x- 1.113 7，R2=0.999 6。结果表明对肼基苯磺酰胺盐酸盐的峰面积与其浓度呈较好的线性关系，可用来进行对肼基苯磺酰胺盐酸盐含量测定。

3.4.2 专属性试验

以2.1 项溶液的配制方法分别配制对肼基苯磺酰胺盐酸盐供试品溶液、对照品溶液。分别量取空白溶剂、供试品溶液及对照品溶液各10 μL，按照2.1 项色谱条件进样检测分析，并记录色谱图。

稀释剂色谱图如图3 所示。

图3 稀释剂色谱图Fig.3 Diluent chromatogram

供试品溶液色谱图如图4 所示。

图4 供试品溶液色谱图Fig.4 Chromatogram of the test solution

对照品溶液色谱图如图5 所示。由以上色谱图可知，空白溶剂对对肼基苯磺酰胺盐酸盐的检测无干扰，该方法的专属性良好。

图5 对照品溶液色谱图Fig.5 Chromatogram of reference solution

3.4.3 检测限和定量限

用流动相配制系列浓度对肼基苯磺酰胺盐酸盐对照品溶液，分别进样；记录色谱图和S/N，进行检测限、定量限的测试，S/N=3 对应的浓度为检测限，S/N=10 对应的浓度为定量限。结果表明对肼基苯磺酰胺盐酸盐的检测限为0.167μg/mL；DPDMP 的定量限为0.501 μg/mL。

3.4.4 稳定性试验

溶液的稳定性研究用来证明根据相应方法制备溶液在规定的储存条件下在一定时间内保持稳定。按照2.2 项下制备供试品溶液，储存在室温条件下，于适宜时间点分别进样。考察各时间点下供试品溶液中对肼基苯磺酰胺盐酸盐的峰面积变化情况，按照2.1 项色谱条件进行检测分析，并记录其峰面积。

对肼基苯磺酰胺盐酸盐含量测定溶液稳定性结果见表3。

表3 对肼基苯磺酰胺盐酸盐含量测定溶液稳定性结果Table 3 Solution stability results for determination of 4-Hydrazinobenzene-1- sulfonamide hydrochloride content

由表3 可见，对肼基苯磺酰胺盐酸盐的峰面积RSD为0.35%，＜2.0%，结果表明该溶液稳定性良好。

3.4.5 重复性试验

按照2.2 项方法配制6 份供试品溶液，以2.1项的色谱条件进行测试分析，记录峰面积。同样，根据对照品溶液的制备方法配制相应的对照品溶液，进行检测分析，并记录峰面积。

对肼基苯磺酰胺盐酸盐含量测定重复性结果见表4。

表4 对肼基苯磺酰胺盐酸盐含量测定重复性结果Table 4 Repeatability results for determination of 4-Hydrazinobenzene-1- sulfonamide hydrochloride content

由表4 可见，平均峰面积为95.252，RSD 为0.29%。该试验结果显示，对肼基苯磺酰胺盐酸盐峰面积的RSD＜2.0%，表明本方法重复性良好。

3.4.6 加样回收率试验

取9 份已知准确含量的供试品溶液，分别加入塞来昔布关键中间体对肼基苯磺酰胺盐酸盐的对照品，按照2.2 项样品制备方法和2.1 项色谱条件进行分析，测定峰面积。

对肼基苯磺酰胺盐酸盐回收率试验结果见表5。

表5 对肼基苯磺酰胺盐酸盐回收率试验结果Table 5 Recovery test results of 4-Hydrazinobenzene-1- sulfonamide hydrochloride

由表5 可见，对肼基苯磺酰胺盐酸盐的加样平均回收率为99.77%，RSD 为0.40%。结果表明本方法准确度较好。

3.5 样品含量测定

取3 批自制对肼基苯磺酰胺盐酸盐样品，按照2.2 项制备方法配制供试品溶液。并按照2.1 项色谱条件进行检测，检测结果见表6。结果表明，采用HPLC 法，测定对肼基苯磺酰胺盐酸盐的含量，操作简单，专属性良好。对肼基苯磺酰胺盐酸盐三批样品的含量均＞99.0%。

表6 3 批自制对肼基苯磺酰胺盐酸盐样品含量测定结果Table 6 Determination results of 4-Hydrazinobenzene-1-sulfonamide hydrochloride samples in 3 batches

3 批自制对肼基苯磺酰胺盐酸盐样品含量测定结果见表6。

4 结 语

对肼基苯磺酰胺盐酸盐作为肼的有机衍生物，是塞来昔布合成工艺中的关键中间体，其含量对于制备塞来昔布的工艺而言，是十分重要的质量研究内容。本试验根据高效液相色谱法测得的相关数据，建立了一套对肼基苯磺酰胺盐酸盐的高效液相色谱检测方法，用于控制关键中间体的质量，即采用高效液相色谱法，色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18 柱（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：缓冲液（1.65 g 庚烷磺酸钠置于1 000 mL 容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，用三氟乙酸调pH 值至2.5）∶乙腈=88∶12；流速为1.0 mL/min；进样量为20 μL；检测波长为233 nm；柱温为25 ℃。

经过试验证明该方法可以直接用于检测对肼基苯磺酰胺盐酸盐含量。本试验开发的方法通过系统适应性试验和方法学考察，表明该方法具有分析时间短、方法稳定准确、专属性、重复性良好等优点，可用于对肼基苯磺酰胺盐酸盐的质量研究。目前针对对肼基苯磺酰胺盐酸盐多为合成工艺的研究，而本试验仅完成了含量测定方法的确定。下一步需要对对肼基苯磺酰胺盐酸盐进行更多的质量研究，如性状、鉴别（色谱法和光谱法）、有关物质及稳定性研究等，为塞来昔布及其制剂的质量控制提供更多参考依据。