基于HS-SPME-GC-MS 对不同等级双井绿茶香气物质的研究

2024-05-12赵志强陈罗君雷志勇高银祥

食品工业科技 2024年10期

赵志强，陈罗君，饶雨，徐璐，饶军，雷志勇，张丽,3，高银祥,3,*

（1.九江学院药学与生命科学学院，江西九江 332005；2.修水县茶叶科学研究所，江西九江 332400；3.九江学院江西油茶研究中心，江西九江 332005）

茶是三大无酒精饮料之一，因其独特的风味及保健功效受到全世界人民的喜爱[1-2]。根据加工工艺不同，茶可分为：绿茶、白茶、黄茶、乌龙茶、红茶和黑茶。绿茶作为一款非发酵茶，在我国茶叶生产销售独占鳌头[3-4]。双井绿茶属于绿茶，产自江西省修水县，因其外形卷曲细紧、翠绿多毫，形如凤爪，汤色明亮，内质散发清香高雅，滋味醇厚甘美而闻名于世。双井绿茶的加工工艺包括摊青、杀青、揉捻、初烘、做型、定型烘干、提香干燥等步骤，使其获得独特的风味品质[5]。

茶叶香气是评价茶叶品质的关键因子，茶叶中香气物质种类及其含量使茶叶呈现独特香型[6]。茶树品种、茶树生长环境、茶叶加工工艺等影响茶叶香气物质，其中采用的鲜叶原料是影响茶叶香气的关键因素[7-9]。Peng 等[10]对不同等级的九曲红梅香气物质进行研究，结果表明有5 种挥发性化合物的相对含量与九曲红梅茶等级呈正相关。丁玎等[11]对4 个等级的白茶中的香气进行分析，共鉴定出51 种香气组分，其中醇类物质和醛类物质占比高达70.54%的比例。综上所述，不同等级茶之间的香气物质存在明显差异。

顶空固相微萃取（Headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）是通过固相萃取头涂层对茶叶香气物质进行吸附，在气相色谱-质谱联用（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）GC/MS进样口用高温将萃取头香气物质解吸附、进行进样检测；GC-MS 可以对茶叶中香气物质进行快速分离，通过质谱信息、对比质谱数据库进行鉴定，具有定性定量分析功能。GC-MS 和HS-SPME 联用可快速地分析茶叶中的挥发性化合物，真实地反映茶叶香味物质特征[12-13]。

关于双井绿茶香气物质的组成特征的研究，目前尚未见相关报道，特别是不同等级双井绿茶中的香气物质有何差异还不清楚。本研究以江西省修水县同一茶叶产地、同一加工工艺条件，不同芽叶制作的不同等级的双井绿茶为研究对象，利用GC-MS 和HS-SPME 联用技术，对不同等级双井绿茶的香气物质组成及含量进行分析，利用主成分分析（Principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法-判别分析（Partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）、热图分析等手段，研究不同等级双井绿茶中香气物质的组成及含量变化，分析关键香气物质的分布变化规律，为双井绿茶的生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

双井绿茶叶样品来自修水县大椿茶厂，茶鲜叶来源于大椿茶厂自有茶园，经摊青、杀青、抖簸等9 道加工工序制成，每个双井绿茶样品分别取3 份，置于干净无味的-20 ℃冰箱中；纯净水华润怡宝饮料（中国）有限公司；C7～C40 饱和烷烃混标西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司（Sigma-Aldrich）。

固相微萃取头SPME 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 美国Supelco 公司；20 mL 顶空螺纹瓶加磁吸式顶空瓶盖安捷伦科技（中国）有限公司；TG-5MS 气相色谱柱 30 m×0.25 mm×0.25 μm、TSQ 8000Evo 气相色谱-三重四极杆质谱联用仪、TriPlus RSH 三合一自动进样器美国Thermo Fisher 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 双井绿茶样品分级根据双井绿茶芽叶形态及其相对含量，芽叶形态如图1 所示，分为双井银毫（Yinhao Grade，YHG）、双井绿茶特级（Shuangjing Green Tea Super Grade，SUG）、双井绿茶一级（Shuangjing Green Tea First Grade，FG）和双井绿茶二级（Shuangjing Green Tea Second Grade，SG）四个级别。双井银毫（YHG）：单芽和一芽一叶初展为原料，其中单芽相对含量＞85%；双井绿茶特级（SUG）：一芽一叶初展和一芽一叶开展为原料，其中一芽一叶初展相对含量＞75%；双井绿茶一级（FG）：一芽一叶开展和一两叶为原料，其中一芽一叶开展相对含量＞75%；双井绿茶二级（SG）：一芽二叶开展和一芽三叶为原料，其中一芽二叶开展小＜3 cm，相对含量＞80%。

图1 茶树芽叶形态Fig.1 Bud and leaf morphology of Camellia sinensis

1.2.2 样品处理所有样品磨碎，过40 目筛，精确称取1.50 g 茶粉末样品，置入20 mL 样品瓶，加4.50 mL 水（加入1.50 g 氯化钠）。

1.2.3 固相微萃取条件固相微萃取条件参考本实验室之前的实验方法[14]。60 ℃平衡30 min，平衡完成，插入已老化（或已解吸附）的纤维萃取头，于茶样上方顶空吸附（萃取温度60 ℃，萃取时间60 min），后将萃取头进样解析（解析时间5 min，250 ℃）。

1.2.4 GC-MS 检测条件 GC-MS 检测条件参考本实验室之前的实验方法[14]。载气为高纯氦气（纯度不小于99.999%），恒流流速1.0 mL/min，质谱接口温度280 ℃，不分流进样，质谱条件：电子轰击离子源（EI）温度300 ℃。电子能量70 ev；质谱扫描范围：m/z 33～550 amu。程序升温条件：40 ℃（保持2 min），5 ℃/min，85 ℃（保持2 min），2 ℃/min，110 ℃（保持2 min），4 ℃/min，220 ℃（保持2 min），5 ℃/min，250 ℃（保持10 min）。

1.2.5 保留指数的测定及计算方法 C7～C40 混标检测，正构烷烃混标浓度1000 μg/mL（1000 ppm），用正己烷（色谱级）稀释至10 μg/mL（10 ppm）。手动进样1 μL，浓度为10μg/mL C7～C40 混标进GC-MS检测，用以计算保留指数。香气物质的定性定量参考本实验室之前的方法[14]。香气组分质谱数据在NIST2014 库以及自建库中进行检索，筛选出RSI 大于800 的化合物，计算化合物的保留指数RI，并与文献中的保留指数，进行对比，通过RSI 和RI 进行香气组分定性；香气成分的相对含量采用峰面积归一法计算。保留指数根据下式计算：

式中：RIX：化合物X 的保留指数（X 在正构烷烃Z 和Z+1 之间馏出）；RTX：化合物X 的保留时间；RTZ：碳数为Z 的正构烷烃的保留时间；RTZ+1：碳数为Z+1 的正构烷烃保留时间。

1.3 数据处理

本研究每个测定实验均重复3 次，实验数据采用IBM Statistics SPSS 23.0 软件进行单因素方差分析，水平间比较用LSD 法和Duncan 法，P＜0.05，差异显著，P＜0.01，差异极显著。采用TBtools 绘制热图，多元统计分析采用SIMCA-P 14.1 软件。

2 结果与分析

2.1 不同等级双井绿茶香气组分GC-MS 分析

不同等级双井绿茶经GC-MS 检测，得到双井绿茶总离子流色谱图，如图2 所示，本实验采用的HSSPME 及GC-MS 梯度升温方法可以有效提取分离检测双井绿茶香气组分。香气组分总离子流图结果显示，不同等级的双井绿茶总离子流图差异明显，同一等级的双井绿茶香气总离子流图结果更加相似。

图2 不同等级双井绿茶香气组分总离子流色谱对比图Fig.2 Total ion chromatogram of aroma compounds of Shuangjing green tea with different grades

2.2 不同等级的双井绿茶香气组分定性分析

利用GC-MS 并通过RSI 和RT 在4 种不同等级双井绿样品中共鉴定出了70 种香气成分（表1），根据香气组分主要官能团的不同，可分为7 大类，其中醇类17 种，醛类7 种，酮类5 种，酯类8 种，烯烃12 种，烷烃9 种，杂环类7 种，其它化合物5 种。邓见田烨等[15]利用HS-SPME-GC-MS 分析检测不同种类黑茶香气物质，共检测鉴定出56 个香气成分。李沅达等[16]对不同加工工艺的紫鹃白茶的香气组分进行检测，共检测鉴定出82 种香气物质。不同的茶叶类型、不同的检测仪器及不同的检测方法会导致检测结果差异。

表1 不同等级双井绿茶香气成分Table 1 Aroma components of Shuangjing green tea with different grades

2.3 不同等级双井绿茶总香气组分变化分析

TBtools 是一款用于高通量数据分析的工具[17]，利用TBtools 绘制热图，可以直观地比较香气组分含量的变化，如图3 所示，色阶颜色从蓝到红的变化代表了相对含量从低到高，从图3 可以观察到，在双井银毫、双井特级（芽占比较高）中反式-β-金合欢烯、2-甲基十五烷、δ-杜松烯、庚醛、雪松烯、顺式-香叶醇、2,6-二叔丁基对甲基苯酚、壬醛、2,6,10 -三甲基-十四烷、反式香叶酸、石竹烯、γ-依兰油烯、2-甲基十三烷等香气组分相对含量较高；随着芽叶开展，在双井一级、双井二级（一芽二叶、一芽三叶占比较高）中相对含量较高的有苯乙醇、柠檬醛、顺式-3-己烯醇、香叶醇、5-甲基-2 庚烯-6-酮、β-柠檬醛、苯甲醛、苯甲醇、顺式-芳樟醇氧化物（呋喃类）及水杨酸甲酯等。

图3 不同等级双井绿茶香气组分的热图分析Fig.3 Heatmap analysis of aroma compounds of Shuangjing green tea with different grades

2.4 不同等级的双井绿茶香气组分主成分分析

由于茶叶中香气成分复杂多样，很难以单一的香气成分和简易的数据分析获得有效变量，多元统计分析是一种综合分析方法，通过分析双井绿茶样品的统计学规律，可以在多个对象和指标相互关联时进行分析[18]。为了探索具有四种不同等级的双井绿茶样品鉴别的潜在化学标记，使用多元统计分析对所鉴定得出的70 种香气成分进行差异性分析。

为了研究不同等级茶叶样品中挥发性化合物组成的相似性和差异性，以这些检测到的香气物质相对含量为变量，进行了主成分分析（PCA），PCA 通过降维将多个变量转化为几个综合变量，从而直观地反映样本的某些特征多变量、无监督的统计分析方法，被广泛应用于茶叶挥发性成分研究[19]。如图4 所示，根据不同等级的双井绿茶香气组分的相对含量构建的PCA 模型吻合程度（R2）和模型预测能力（Q2）分别为0.897 和0.751，这表明PCA 对数据具有较好的适应度，不同等级的双井绿茶样品区分明显。

图4 不同等级双井绿茶香气组分的PCA 分析图Fig.4 PCA analysis of aroma compounds of Shuangjing green tea with different grades

层次聚类分析（Hierarchical Clustering Analysis，HCA）是将对象根据其在多维空间中的接近程度分组成簇，将最大相似性的样本为优先聚类[20]。如图5 所示，四种不同等级双井绿茶可以在聚类距离70 处被清晰地分成4 个聚类，其中第一组为双井绿二级聚类，第二组为双井银毫，第三为双井绿特级，第四组为双井绿一级。随着聚类距离增加，双井特级和双井一级距离更近，而双井二级与其他3 组距离最远，说明在四种不同等级的茶样香气组分，双井特级与双井一级的香气物质更相似，而双井二级香气组分与其他3 组差异更大，说明芽叶生长直至完全展开，香气组分变化很大，而芽中的香气组分变化较小。

图5 不同等级双井绿茶HCA 聚类分析图Fig.5 HCA clustering analysis of Shuangjing green tea with different grades

偏最小二乘-判别分析（PLS-DA）是一种监督聚类的分类方法，可以弥补PCA 的不足，加强样本之间的差异，并提供负责分离的关键香气成分的指示[21]。采用PLS-DA 法比较了四种绿茶的香气物质特征。在模型中不同等级双井绿茶香气组分之间存在显著差异。参数（R2Y=0.991）具有很高的解释能力，Q2=0.969 具有较强的预测能力。如图6 所示，银毫一级位于得分图的右上方，双井特级和双井一级集中在右下方，双井二级单独位于得分图的左下方。4 个不同等级双井绿茶的样品得到了很好的区分。

图6 不同等级双井绿茶PLS-DA 分析图Fig.6 PLS-DA analysis of aroma compounds of Shuangjing green tea with different grades

VIP 值可以量化PLS-DA 模型中香气组分对样本分类的贡献大小，在判别过程中一般认为VIP＞1，影响样本相似性的关键因素，P＜0.05 表示该组分具有统计学意义[22]。如图7 所示：在本研究中VIP＞1共有19 种香气物质：反式-β-金合欢烯、香叶醇、水杨酸甲酯、（Z）-茉莉酮、苯甲醇、苯乙醇、十四烷、反式-橙花醇、石竹烯、反式-芳樟醇氧化物、1-辛醇、己酸乙酯、2,6,10-三甲基十三烷、芳樟醇、α-椰油烯、壬醛、（Z,E）-α-法呢烯、咖啡因、顺式-3-己烯醇。其中VIP＞1，同时P＜0.05，如表2 所示，反式-β-金合欢烯、香叶醇、水杨酸甲酯、（Z）-茉莉酮、苯乙醇、十四烷、反式-橙花醇、石竹烯、反式-芳樟醇氧化物、1-辛醇、己酸乙酯、芳樟醇、α-椰油烯、顺式-3-己烯醇，这14 种香气组分是不同等级双井绿茶在香气上产生差异的关键物质。这些变化的关键性香气组分主要表现为花香、果香、木香、焦糖香及青香等[23-26]。

表2 不同等级双井绿茶香气组分差异关键物质Table 2 Key substances for different aroma components of Shuangjing green tea with different grades

图7 不同等级双井绿茶香气组分PLS-DA 模型的VIP 得分图Fig.7 VIP score diagram of PLS-DA model for aroma compounds of Shuangjing green tea with different grades

2.5 不同等级的双井绿茶关键差异物质变化分析

根据PLS-DA 模型，利用VIP＞1 且P＜0.05，共筛选出14 种关键差异物质，具体见表2，分别为反式-β-金合欢烯、香叶醇、水杨酸甲酯、（Z）-茉莉酮、苯乙醇、十四烷、反式-橙花醇、石竹烯、反式-芳樟醇氧化物（吡喃类）、1-辛醇、己酸乙酯、芳樟醇、α-椰油烯以及顺式-3-己烯醇。为了呈现上述香气化合物在不同等级双井绿茶品质中的含量差异，以及探索它们之间的关系，将14 种关键差异物质香气含量制成热图，如图8 所示，结果表明以单芽为主的银毫一级与双井绿茶特级中呈现果香、木香为主的反式-β-金合欢烯、α-椰油烯、石竹烯、己酸乙酯相对含量较高；随着芽叶开展，在双井绿茶一级与双井绿茶二级中呈现花香、青香为主的水杨酸甲酯、香叶醇、顺式-3-己烯醇相对含量迅速增加；而芳樟醇、茉莉酮、反式-橙花叔醇含量从低到高，随后含量又迅速下降。

图8 不同等级的双井绿茶关键差异物质热图Fig.8 Heatmap analysis of key aroma compounds of Shuangjing Green Tea with different grades

绿茶的特征香气在很大程度上取决于关键香气物质，并且茶叶中芳樟醇和香叶醇的含量对茶叶的香气品质有一定影响[27-28]。茉莉酮具有典型的果香、花香和木香，水杨酸甲酯的杏仁香及焦香，橙花醇具有草木香、氧化芳樟醇（吡喃类）具有花香、苯乙醇具有花香，顺式-3-己烯醇具有青草香[29-31]，这些香气组分呈现了花香、果香、木香和青香等香型，这些香气组分的种类和含量导致了双井绿茶的整体的呈现的独特的茶香。

3 结论

本研究基于HS-SPME-GC/MS 联用技术对四种不同等级的双井绿茶的香气组分进行检测分析，共鉴定出70 种香气物质。结果表明，四组不同等级双井绿茶样品的香气组分差异明显。其中反式-β-金合欢烯、2-甲基十五烷、δ-杜松烯、庚醛、雪松烯、顺式-香叶醇、2,6-二叔丁基对甲基苯酚、壬醛、2,6,10 -三甲基-十四烷、反式香叶酸、石竹烯、γ-依兰油烯、2-甲基十三烷等在芽中的相对含量较高。苯乙醇、柠檬醛、顺式-3-己烯醇、香叶醇、5-甲基-2 庚烯-6-酮、β-柠檬醛、苯甲醛、苯甲醇、顺式-芳樟醇氧化物（呋喃类）及水杨酸甲酯等随着芽叶开展，在一芽二叶、一芽三叶中相对含量较高。

其中反式-β-金合欢烯、香叶醇、水杨酸甲酯、（Z）-茉莉酮、苯乙醇、十四烷、反式-橙花醇、石竹烯、反式-芳樟醇氧化物（吡喃类）、1-辛醇、己酸乙酯、芳樟醇、α-椰油烯以及顺式-3-己烯醇是不同等级双井绿茶的关键差异性物质，这14 种香气组分是不同等级双井绿茶在香气上产生差异的关键物质。

综上，本研究揭示了不同等级双井绿茶中香气物质的组成，加深了关键香气物质在芽叶中的分布规律的认识，为双井绿茶的生产提供理论参考。