基于网络药理学探讨川牛膝治疗高血压的作用机制

梁林辉,梁大伟 ,章斌,林浩

(雅安职业技术学院 药学与检验学院,四川 雅安 625000)

川牛膝(CyathulaofficinalisKuan,CNX)为苋科植物川牛膝的干燥根又称为白牛膝、拐牛膝、甜牛膝,具有逐瘀通经,通利关节,利尿通淋的功效[1]。川牛膝在治疗高血压病中使用非常广泛,通过中医药治疗高血压病总体用药规律发现,常用中药中川牛膝使用率排第二[2]。同时,在高血压病诊治中,将川牛膝作为降压的基础方之一来使用,降压效果非常明显[3]。在药理学研究方面,发现川牛膝醇提物可能通过下调肺组织PI3K/Akt信号通路来抑制氧化应激反应,进而降低肺血管重构,因此可以降低野百合碱诱导的肺动脉高压[4]。目前,川牛膝治疗高血压的具体作用机制不明确。网络药理学分析可作为一种研究由复杂成分的中药或制剂的有效手段来揭示药物发挥作用的药理机制。因此,本研究借用网络药理学的方法,通过分析川牛膝的有效成分,预测川牛膝治疗高血压的靶点和信号通路,期望揭示川牛膝治疗高血压的分子机制,为川牛膝进一步临床应用和基础研究提供参考。

1 方法

1.1 川牛膝的活性成分和靶蛋白的获得

利用中药系统药理学数据库与分析平台数据库(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform ,TCMSP)获得川牛膝化学成分,然后基于药代动力学参数吸收、分布、代谢、排泄(absorption、distribution、metabolism、excretion,ADME)中的口服利用度(Oral Availability,OB)≥20%,类药性(Drug Like,DL)≥0.1进行活性成分筛选[5],同时通过查阅已公开发表文献资料川牛膝中重要药理活性的成分,结合两种途径获得川牛膝化学成分。将筛选出的活性成分再通过TCMSP、本草组鉴(High-throughput Experiment and Reference Guided Database,HERB)数据库中及瑞士靶点预测工具(Swiss Target Prediction,STP)获取对应的靶蛋白,利用通用蛋白质资源库(Universal Protein,Uniprot)进行基因标准化。

1.2 川牛膝治疗肺高血压关键靶点的获取

通过在线《人类孟德尔遗传》(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)数据库,药物数据库(Drugbank),治疗靶点数据库(Therapeutic Target Database,TTD),毒性与基因比较数据库(Comparative Toxicogenomics Database,CTD)和疾病基因网络(Disease Gene Network,DISGENT)数据库中,以“Hypertension”为检索词检索疾病靶蛋白,其中CTD数据库以“Inference Score”≥9.63为筛选条件,再对5个数据库获得的靶蛋白进行合并和去重,得到高血压疾病靶点。

将川牛膝靶点与高血压相关靶点利用在线作图工具(http://www.biovenn.nl),获取川牛膝与高血压的共同靶点,获得川牛膝治疗高血压关键靶点。

1.3 关键靶蛋白PPI网络的构建

药物发挥药理作用除了作用于直接靶点调控之外,更多是直接靶点和间接靶点互相结合的调控方式。蛋白质-蛋白质之间的相互作用(Protein-Protein Interaction,PPI)分析有助于从系统的角度研究和挖掘药物新靶点和阐明药物治疗疾病的分子机制。将川牛膝治疗高血压关键靶点导入String数据库获得PPI网络数据信息,并将数据导入Cytoscape3.7.0软件进行网络构建和分析。

1.4 GO功能富集分析和KEGG分析

将川牛膝治疗高血压关键靶点导入Metascape数据库进行基因本体论(Gene ontology,GO)以及京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析。以智人为筛选条件,显著性阈值设为以P<0.01为选择标准,对结果进行筛选,并做气泡图进行可视化分析。

2 结果

2.1 川牛膝的活性成分和靶蛋白的获得

在TCMSP数据库中搜索川牛膝得到药物有效成分共41个。按ADME参数口服生物利用度OB≥20%,类药性DL≥0.1筛选得到11个潜在活性成分;另外,通过查阅文献发现cyasterone具有治疗高血压的潜在药理作用[6],共组成12个川牛膝潜在活性成分。通过TCMSP、HERB、获得活性成分靶蛋白,对于没有靶蛋白的活性成分进行Swiss Target Prediction 靶点预测,对靶蛋白进行去重、通过Uniprote、Drugbank或美国国家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)数据库进行基因名转换,删除重复及无法获得基因的蛋白,最终得到9个活性成分(见表1)及211个活性成分靶点。

表1 川牛膝主要活性成分

2.2 川牛膝治疗高血压关键靶点的获取

以“Hypertension”为检索词收集高血压相关靶点,在OMIM数据库获得148个靶点,在TTD数据库获得106个靶点,在CTD数据库获得1050个预测靶点(Inference Score≥100),在Disgenet数据库获得445个靶点,在Drugbank数据库获得178个靶点。将五个数据库靶点集合并去掉重复最终得到高血压相关靶点1540个。通过对疾病靶点与川牛膝作用靶点映射取交集,得到二者交集靶点170个。见图1。

图1 疾病靶点与药物靶点韦恩图

图2 川牛膝治疗高血压的PPI网络图

2.3 关键靶蛋白PPI网络的构建

将川牛膝治疗高血压的170个关键靶点导入String数据库进行靶点分析和网络预测,所得结果导入Cytoscape软件进行网络构建及可视化分析。隐藏无线的节点,用自由度Degree值表示圈的大小和颜色深浅,Degree值越大,圆圈越大,颜色越偏红色,代表参与生物信号路径越多,如图3所示,发挥关键作用的靶点为IL6(Degree=78)、AKT1(Degree=74)、TP53(Degree=71)、VEGFA(Degree=70)、TNF(Degree=69)、PTGS2(Degree=64)、EGFR(Degree=63)、CASP(Degree=62)、MMP9(Degree=61)和STAT3(Degree=61)等。

图3 川牛膝治疗高血压靶点的GO富集分析

2.4 GO功能富集分析和KEGG分析

将川牛膝治疗高血压的170个关键靶点导入Metascape数据库,进行基因本体论GO和KEGG分析,其中,GO分子功能(Molecular function,MF)富集最高的20个涉及细胞因子受体结合、转录因子结合、核受体活性、血红素结合、激酶结合等;GO细胞学组分(Cellular Component,CC)共15个,富集最高的涉及细胞膜筏、膜的侧面、细胞顶端、细胞质核周区、细胞外基质等;GO生物学进程(Biological process,BP)富集最高的20个涉及炎症反应、对伤害的反应、对脂多糖的反应、活性氧代谢过程、凋亡信号通路等。KEGG分析富集最高的20条信号通路主要涉及糖尿病并发症AGE-RAGE 信号路径、肿瘤的途径、乙型肝炎、TNF信号通路、肿瘤中的蛋白质多糖等。川牛膝治疗高血压的生物学进程分析和KEGG分析如图3～4。

图4 川牛膝治疗高血压靶点的KEGG通路富集分析

3 讨论

高血压是常见的心血管疾病,以体循环动脉血压持续高于正常水平为主要特征,能导致人的心、脑、肾、视网膜、血管等病理性改变,可诱发脑血管硬化和冠状动脉粥样硬化,严重威胁人类的健康。高血压在中医中归属“眩晕”“头痛”等范畴,临床表现有头痛、头晕、目眩、耳鸣等[7]。其中医病因病机主要为营液内虚,水不涵木,木气偏亢,甚则化风,治法治则以滋营阴、养肝肾为基础,并结合风、痰、火、瘀等症,随证治之[3,8]。

川牛膝具有活血通经、滋肝补肾,强筋健骨、利水通淋、引火(血)下行的功效,中医在治疗高血压用药规律表明,川牛膝使用频率极高[9]。现代药理学表明,川牛膝主要成分为三萜皂苷、甾酮、多糖,及少量黄酮类等成分[10],通过数据整理筛选出9种有效成分,主要为黄酮类槲皮素、葛根素以及甾体类如杯苋甾酮、红苋甾酮、β-谷甾醇、齐墩果酸、西托糖苷等。槲皮素药理作用广泛,具有扩张血管及降压作用,临床试验表面,槲皮素能直接激活人类血管平滑肌细胞KCa,提示槲皮素激活钙激活钾通道可能是其降血压的一种机制[11]。同样动物实验证明,在高血压合并脑卒中小鼠中,槲皮素能通过活化血小板,减少血小板炎性因子的释放,进而降低脑血栓中血小板堆积的致密程度和覆盖率,降低小鼠的脑梗死体积和神经评分,增加小鼠存活率[12]。槲皮素也可能通过调节肠道菌群,下调TLR4/NF-κB途径,降低自发性高血压大鼠血压及改善心室重构[13]。葛根素主要存在豆科植物野葛的根,与槲皮素结构相似,葛根素通过 TRPC3 抑制 NF-κB 激活从而下调Cx43的表达,促进血管平滑肌细胞向收缩表型转化,进而改善血管舒缩功能[14],并且在瘀血内阻型原发性高血压疾病研究中发现,葛根素注射液联合厄贝沙坦能有效控制血压,改善临床症状[15]。齐墩果酸作为一种具有广泛活性的三萜类化合物,在高血压动物模型上研究较多,可明显改善高血压动物收缩压的升高,齐墩果酸的降压作用也与其利尿作用相关[16]。通过SwissTargetPrediction 预测分析得到的川牛膝有效成分靶点Carboxylesterase 2[17]、11-beta-hydroxysteroid dehydrogenase 1[18]、Progesterone receptor[19]等明显与高血压有相关性,为进一步在体外或体内研究川牛膝治疗高血压的机制提供了方向。

高血压的发病机制未完全清晰,疾病的发生可能是由多基因和环境共同照成的,与炎症反应、脂多糖、活性氧代谢等因素密切相关[20-22]。本研究构建川牛膝治疗高血压PPI网络,发现IL-6、AKT1、TP53等核心靶点。IL-6为白细胞介素-6,研究表明,越来越多的证据支持炎症和免疫与高血压有关,炎症的发生会导致IL-6释放,进而刺激单核细胞转化为抗原呈递细胞并产生IL-1β和IL-23等细胞因子,进一步影响T细胞功能以产生IL-17A。这些细胞因子能导致高血压产生以及终末器官损伤[23],这也为高血压的治疗提供了新的方向。AKT磷酸化激活内皮一氧化氮合成酶,导致内皮血管松弛,进而影响血压[24]。肿瘤抑制剂蛋白p53与动脉平滑肌细胞凋亡的分子机制有关,直接参与高血压的发病机制[25]。

川牛膝治疗高血压关键靶点的GO功能富集发现,涉及炎症反应、对伤害的反应、对脂多糖的反应、活性氧代谢过程、凋亡信号通路等。KEGG分析富集最高的20条信号通路主要涉及糖尿病并发症AGE-RAGE 信号路径、肿瘤的途径、乙型肝炎、TNF信号通路、肿瘤中的蛋白质多糖等。通过富集分析及文献可以推出,川牛膝治疗高血压主要通过以下几个通路发挥调控血压的作用。Ⅰ:炎症反应相关通路。高血压与免疫系统活化及迁移至多种靶器官如血管系统、肾脏、大脑、心脏等密切相关,炎症机制对血压调节及靶器官至关重要[26-28]。Ⅱ:糖尿病并发症AGE-RAGE相关通路。AGE-RAGE在在高血压患者的血浆中表达较高,影响动脉结构及血管功能。糖基化与受体反应可以导致氧化应激的发生,AGE与RAGE的相互作用可通过活性氧的产生,交感神经活性增加,NF-kB因子的活化以及细胞因子、细胞粘附分子和TGF-β的表达增加而产生高血压[29-30]。目前,常用的降压药如卡托普利、氯沙坦等均为通过AGE-RAGE相关通路起到降低血压的作用。Ⅲ:肿瘤及细胞凋亡信号路径。高血压以及持续性高血压会诱发心肌形态学变化及心肌功能障碍,可导致心肌间质纤维化或心肌细胞凋亡[31-32]。减少心肌细胞的凋亡对预防和治疗高血压有重要的临床意义。

总体来说,通过网络药理学研究发现了川牛膝可通过多靶点、多通路来治疗高血压。高血压的发病机制复杂,而川牛膝有效成分多,需要系统研究中药治疗疾病的作用机制。本研究基于活性成分、核心靶点以及信号通路进行归纳分析,为进一步研究川牛膝治疗高血压的作用机制提供一定的方向。同时,也为中医药治疗高血压提供了思路及理论基础。